皂苷作为疫苗免疫佐剂的研究进展

孙超钰，刘燕华，李扛，戴书通，李铭东

（江西中医药大学药学院，江西南昌 330004）

随着现代社会的发展，医疗技术突飞猛进，催生出许多先进的医疗手段，疫苗就是科技发展的代表性产物之一。疫苗是将病原微生物及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用转基因等方法，制成用于预防传染病的自动免疫制剂[1]。由于灭活疫苗的抗原免疫原性较弱，单独使用往往达不到有效的免疫强度，必须在抗原中添加佐剂，从而辅助提升免疫应答强度[2]。佐剂是指与抗原同时或预先使用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力或改变免疫反应类型的一类物质，在疫苗中发挥辅助或者辅佐作用[3]，在20 世纪早期就被使用到临床。目前临床常用的佐剂有铝佐剂、多糖佐剂、细胞因子佐剂、皂苷佐剂等，并不断有AS01、AS04 等复合佐剂被开发出来。铝佐剂是指以氢氧化铝等铝盐为主要成分的佐剂，因具有较好的吸附能力而成为广泛使用的佐剂之一。它不仅能够增强免疫反应，而且还能激活树突状细胞和补体，促进抗原的提呈，但是副作用较大，因此不断提高铝佐剂的安全性是开发新型铝盐佐剂的趋势之一。多糖是自然界普遍存在的一类结构多样的生物大分子[4]。我国首个以多糖为佐剂的疫苗——13 价肺炎球菌多糖结合疫苗于2020 年获批上市。该疫苗使用肺炎球菌荚膜多糖偶联载体蛋白形成免疫复合物，用以预防肺炎球菌引起的疾病。研究[5]表明，多糖作为疫苗佐剂，毒性低、安全性高且免疫反应迅速，具有较大的发展空间。细胞因子是一大类水溶性小分子多肽或蛋白质[6]，多属于内源性物质，种类多样，生物相容性高，作为免疫佐剂可获得更强的免疫调节效果。

皂苷是一类广泛存在于植物中的糖苷类化合物。皂苷佐剂开始进入研究者的视野，源于从南美皂树中提取到的一种皂树皂苷，其既能刺激Th1型免疫应答，又能诱导细胞毒性T 淋巴细胞应答，具有高佐剂活性。皂苷主要来源于植物，作为天然产物，它自身具有一定的免疫反应活性，不仅能减少疫苗接种次数，延长作用时间，还能通过减少抗原用量从而提升疫苗的安全性，这也是皂苷佐剂低毒、高效的依据。虽然皂苷优势明显，但仍存在溶血性、细胞毒性等弊端，要想将皂苷逐步应用到疫苗中还需更多的临床研究。目前只有极少数皂苷佐剂获批上市，美国食品药品监督管理局2017 年批准了一种带状疱疹疫苗Shingrix®[7]。该疫苗的佐剂名为AS01，成分是QS-21 皂苷和单磷脂酰A。本文将重点论述皂苷作为疫苗佐剂的研究进展，以期为开发新型疫苗佐剂提供参考。

1 皂苷作为疫苗佐剂的作用机制

目前皂苷类佐剂研究中以三萜皂苷类为主。三萜类皂苷在自然界分布广泛，其基本结构是不同的苷元母核上连接不同的糖基。三萜皂苷多按其苷元中30 个碳组成环的数目多少，分为四环三萜皂苷和五环三萜皂苷，其中四环三萜皂苷有人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1 等，五环三萜皂苷有柴胡皂苷A、柴胡皂苷D 等。不同结构的皂苷不仅具有不同的药理作用，其作为佐剂使用时的作用机制也可能不同。

皂苷作为疫苗佐剂，在进入机体后会诱导各种免疫相关细胞的分化成熟，比如中性粒细胞的富集，诱导细胞因子的产生，以及巨噬细胞和树突状细胞（DC）[8]的分化成熟。刘永华等[9]研究人参皂苷Rg3 单体对体外培养的DC 分化、成熟及对免疫功能的影响，结果发现人参皂苷Rg3 可诱导DC 分化和成熟，并通过促进DC 分泌IL-12 来促进T/NK 细胞的增殖和活化，从而达到增强机体免疫功能的作用。研究[10]表明，皂苷还能有效刺激Th1型免疫应答并产生特异性细胞毒性T 淋巴细胞。Lacaille-dubois[8]研究发现，QS-21 可诱导Th1型免疫应答反应，从而有助于保护机体免受许多病原体的侵害。Th1型CD4+T 细胞主要释放促炎细胞因子白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），它们直接或间接地通过CD8+T 细胞激活和分化各种细胞因子以及产生IgG2a 和IgG3，参与清除细胞内病原体。

皂苷能有效增强疫苗的免疫原性是基于皂苷在注射部位具有“仓库效应”，缓慢释放，持久起效，而且还会上调相关免疫基因mRNA 的表达，促进细胞因子和趋化因子的分泌[11]。Nilgun 等[12]研究了黄芪甲苷VII（AST-VII）与不同免疫刺激剂配伍使用后的免疫效果，发现AST-VII 在活疫苗或者灭活疫苗中均能够诱导产生特异性的IgG、IgG1 和IgG2b 抗体应答以及IL-2 和IL-4。当黄芪甲苷VII 与黄芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）配伍使用时，产生的中和抗体增多，并轻微增加IFN-γ 和IL-2 的水平。Sun 等[13]评估了合欢皂苷活性成分（albizia julibrissin saponin active fraction，AJSAF）对小鼠和鸡免疫灭活H9N2 禽流感疫苗的免疫应答作用，发现AJSAF 可显著诱导免疫小鼠脾细胞产生Th1（IL-2 和IFN-γ）和Th2（IL-10）细胞因子，并上调Th1 和Th2 细胞因子及转录因子的mRNA 表达水平，从而达到提升体液免疫和细胞免疫的免疫强度，增强疫苗免疫应答的目的。

2 皂苷作为疫苗佐剂的优缺点

2.1 皂苷佐剂的优点

主要包括：①植物来源广泛，且安全性较高；②自身具有一定的免疫应答作用；③参与调节固有免疫细胞（比如中性粒细胞、树突状细胞等），使其产生非特异性免疫；④上调各种免疫相关因子的基因表达。

三七总皂苷（PNS）是从我国传统中药三七中提取得到的主要活性成分，包含多种单体。陈毓等[14]研究了PNS 的溶血性和体外免疫活性，发现PNS 在0.25 mg/mL 以下时无溶血性，在125 μg/mL 以下时对脾淋巴细胞活力未有抑制作用，显示出较好的安全性；在一定浓度范围内，PNS 对体外诱导的T 淋巴细胞和B 淋巴细胞增殖有极显著促进作用，具有作为免疫佐剂的潜力。Jing 等[15]对肌肉注射卵清蛋白和禽流感疫苗（rLH5）以及AJSAF 小鼠的股四头肌进行了基因芯片分析，发现AJSAF 主要诱导“中性粒细胞”CCL2、CXCL1、CXCL5、IL-1β、IL-6、IL-33、S100A8和S100A9基因的表达，在注射部位诱导细胞因子产生以及中性粒细胞富集，从而增强机体免疫反应。王敏等[16]研究了黄芪皂苷Ⅱ（ASI Ⅱ）通过调控CD45 蛋白酪氨酸磷酸酯酶（CD45 PTPase）诱导抗肿瘤免疫的效应。ASI Ⅱ给药肿瘤模型小鼠后，明显提高了该类小鼠T 淋巴细胞增殖，而且小鼠脾淋巴细胞Th1 细胞因子（IL-2 和IFN-γ）和Th2细胞因子（IL-4）mRNA 表达水平显著提升，表明ASI Ⅱ不仅能提高小鼠的免疫功能，还具有一定的抗肿瘤免疫反应。朱洪卿等[17]研究了裂果薯总皂苷（SSPHs）对H22 荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用及其机制，发现SSPHs 抑制肿瘤效率能达到61.70%，并且可显著提高荷瘤小鼠血清中IL-2、TNF-α 的水平；在免疫组化试验中发现，SSPHs 可使肿瘤组织中的CD4+T、CD8+T 细胞表达增加。这些研究结果表明，SSPHs 可通过上调细胞因子和CD4+T、CD8+T 细胞的表达抑制肿瘤生长，提高抗肿瘤免疫，从而增强机体免疫活性。

2.2 皂苷佐剂的缺点

主要包括：①溶血性；②细胞毒性；③神经毒性；④增加肠道通透性；⑤损害肝脏和肾脏。

孙雨晴等[18]探讨了七叶皂苷钠（七叶皂苷Ia、七叶皂苷Ib、异七叶皂苷Ia 和异七叶皂苷Ib的混合物）对肾细胞的影响，结果发现4 种七叶皂苷异构体均能直接结合到热休克蛋白的ATP 结合域，抑制热休克蛋白发挥应激保护功能，并下调其表达水平。由于热休克蛋白是一类对肾损伤有保护作用的应激蛋白，因此抑制其应激保护功能可能会导致肾损伤。Zhang 等[19]评价了藜麦粗皂苷的安全性，并研究了藜麦粗皂苷对大鼠肠道微生物的影响。结果显示，口服皂苷以后，雌雄大鼠出现不同种的差异代谢物，代谢组学发生改变，而且大鼠肠道菌群增加，肠道黏膜出现不同程度坏死。这与皂苷刺激肠道上皮细胞改变其黏膜结构导致肠道损伤有关。王文平[20]深入研究了重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潜在毒性及其作用机制，发现这3 种单体可明显杀死所选的肝细胞和肾细胞以及多数的心脏细胞，具有明显的细胞毒性，其作用机制主要是诱导细胞凋亡和抑制血管新生；动物试验发现，重楼皂苷Ⅰ毒性最强，而且进一步验证了其心脏和肝脏毒性，并推测重楼皂苷Ⅰ诱导的肝毒性机制是CYP450 酶和脂质代谢介导的线粒体功能障碍为主体的肝细胞损伤。

众所周知，皂苷具有溶血性。随着科学技术的发展，皂苷的溶血性和细胞毒性可以通过一定的技术手段避免或降低。Samuel 等[21]将巴西藜芦皂苷（QB-80）包裹在脂质中制成纳米佐剂（IMXQB-80），经毒性试验发现，IMXQB-80 可降低细胞毒性，而且比QB-80 皂苷诱导等效刺激所需的皂苷少4 倍，说明其毒性更低，效果更好。

2.3 皂苷佐剂与其他常见佐剂的比较

皂苷佐剂与其他常见佐剂相比各有利弊（表1），可以采取各种手段扩大优势或者削弱弊端，使其应用更加安全和广泛。

表1 不同类型佐剂主要优缺点比较

3 皂苷作为疫苗佐剂的应用

3.1 在人用疫苗中的应用

人用疫苗主要针对人类易感传染病所设计，安全性要求极高，从研发、生产到临床，都有严格的质量把控。人用疫苗中比较传统、常见的类型是灭活疫苗和减毒活疫苗，如流感疫苗、甲肝疫苗、乙肝疫苗等。灭活疫苗是将微生物采用适当的方式灭活，使其不具感染性，但保留免疫原性，并与相应的佐剂按一定比例混合后制成的[24]。减毒活疫苗是指将病原体处理后，使其结构发生变化，毒性显著降低，但活性保持不变，并能保持原有抗原性的疫苗。有些疫苗既能制成灭活疫苗，又能制成减毒疫苗。灭活疫苗和减毒活疫苗的免疫原性较弱，通常都需要在疫苗制剂中添加佐剂，以增强疫苗的免疫活性。目前皂苷佐剂的研究主要集中在抗病毒和抗肿瘤疫苗佐剂上，而在一些常见的人用疫苗，如甲肝疫苗、乙肝疫苗、狂犬病疫苗等的研究中却较为少见。

由流感病毒导致的流感每到冬季就进入高发期，老人和孩子因免疫力低下而成为流感的高发人群，而接种疫苗是预防流感的一种有效手段。流感疫苗接种周期短，免疫时间长，因而需要添加免疫佐剂。Buzz 等[25]评估了新型半合成皂苷TQL1055增强流感抗原免疫原性的潜力，并与QS-21 进行了对比，结果发现TQL1055 对流感抗原具有较强的辅助活性，而且具有减少抗原剂量和较好的全身耐受性等特点。该研究进一步支持皂苷在流感疫苗方面具有较好的佐剂活性和更大的发展潜力。为了研究流感疫苗对老年人的保护力，Vassilieva 等[26]建造了老龄小鼠模型，把2′,3′-环鸟苷单磷酸腺苷（cGAMP）与皂苷佐剂结合，然后与亚单位流感疫苗联合应用，结果发现皂苷与cGAMP 联合使用可以提高流感疫苗对老年人群的免疫效力，而无需增加剂量或进行额外接种。

宫颈癌是一种多发于育龄女性的疾病，而99.6%的宫颈癌因HPV 感染引起。HPV 疫苗常见的是二价、四价和九价，后两者我国目前仍主要依靠进口。皂苷在HPV 疫苗中的研究相对较少，但是已有研究结果表明皂苷对于宫颈癌具有一定的治疗作用。高孟等[27]选择5 种具有免疫调节功能的人参皂苷单体，比较了它们对治疗性HPV16 重组疫苗免疫效果的影响，发现人参皂苷Rg1 和Rb1可显著提高HPV16 重组疫苗的特异性细胞免疫应答，具有作为治疗性HPV16 重组疫苗佐剂的潜力。

肺癌是我国临床常见恶性疾病，其患病率和死亡率均居所有恶性疾病前列，而非小细胞肺癌（NSCLC）占全部肺癌病人的80%[28]。谭先胜等[29]研究了绞股蓝皂苷（XLIL）上调可溶性Tim-3（sTim-3）和黏蛋白域3（Tim-3）的比率在NSCLC 细胞免疫逃逸中的作用机制。在NSCLC组中可以观测到，ADAM-10/17 水平和sTim-3表达水平明显下降，Tim-3 表达水平明显上升，ADAM-10/17可以分解Tim-3 得到sTim-3，而sTim-3 具有抑制肿瘤免疫逃逸的作用；与对照组相比，添加XLIL 的肿瘤细胞，无论低、中、高剂量，sTim-3 和Tim-3 的比值均上调，不仅肿瘤细胞的增殖活性和侵袭率显著降低，而且肿瘤细胞中免疫分子IFN-γ 和TNF-α 的表达水平也明显下调。上述研究结果表明，绞股蓝皂苷能够减少NSCLC细胞的免疫逃逸，这也说明其有作为抗NSCLC 疫苗佐剂的潜力。

3.2 在兽用疫苗中的应用

兽用疫苗主要针对动物出现大规模传染病而设计的，对于养殖生产、生态保护等具有重要意义。许多动物一旦染病就会出现大面积死亡，如果提前注射疫苗预防，将会大大降低养殖户的经济损失。兽用疫苗的安全性没有人用疫苗要求那么苛刻，其发展远快于人用疫苗。兽用疫苗的分类与人用疫苗大体相似，主要包括常规疫苗和基因工程疫苗。常规疫苗主要指灭活疫苗和减毒活疫苗，而基因工程疫苗包括亚单位疫苗、基因缺失苗、载体疫苗、核酸疫苗等。因皂苷能够刺激免疫反应，因此被广泛应用于动物疫苗中，其中应用最广的是Quil-A。Quil-A 是一种非均相混合物，毒性较强，虽不适用于人类疫苗，但被广泛用于兽用疫苗[30]。皂苷在兽用疫苗方面的研究较多，基于动物易感染各种病毒而致病，相关研究也主要集中在抗病毒方面。

马立克氏病（Marek′s disease，MD）是由马立克氏病病毒（Marek′s disease virus，MDV）引起鸡的一种高度接触性传染性肿瘤疾病[31]，通常导致养鸡业30%以内的损失，有的可达50%。尽管该病可以用疫苗预防，但随着毒性极强变异毒株的产生，该病的疫苗免疫效果也随之减弱，需要更加有效的疫苗，因此佐剂的选择更加重要。研究发现，meq基因是MDV 致瘤相关基因之一，而L-meq 蛋白可能是该基因的转录抑制子。付本懂等[32]、王帅玉等[33]研究了不同浓度的人参总皂苷对L-meq基因mRNA 水平的影响，发现人参总皂苷会通过提高L-meq基因的含量而抑制meq基因的相关转录，从而诱导MD 肿瘤细胞系——MSB-1 细胞的凋亡；后续研究发现，人参总皂苷中的人参皂苷Rh2体外能够抑制MSB-1 细胞的增殖。人参皂苷不仅能增强疫苗的免疫原性，还有一定的肿瘤抑制作用，可见其具有作为MD 疫苗佐剂的潜力。

H5N1 亚型禽流感是一种人兽共患病，不仅对鸡鸭鹅等家禽的致死率可达100%，造成家禽业严重损失和危害，而且对人类也具有致病性。HA 蛋白是H5N1 禽流感病毒粒子中最丰富的糖蛋白之一。研究表明，HA 蛋白抑制剂在病毒感染早期可以阻断病毒入侵，有效对抗H5N1 禽流感病毒。石婉真[34]研究了薯蓣皂苷类化合物对H5N1 禽流感病毒包膜蛋白HA 的活性影响，发现天然产物马铃薯三糖薯蓣皂苷 chlorogenin 3-O-β-chacotrioside 的结构类似物XC-27 能在体外有效抑制H5N1 亚型禽流感病毒HA 蛋白复制，且对多种毒株敏感。研究者以XC-27 为基础设计合成了两个薯蓣皂苷类化合物XC-27-1 和XC-27-2，试验发现两个化合物在预防模式下对 H5N1 亚型禽流感病毒都有较强的抑制作用，说明其可以在细胞染毒的早期阶段，抑制H5N1 亚型禽流感病毒入侵。薯蓣皂苷类化合物若作为佐剂使用，也许会使H5N1 亚型禽流感疫苗覆盖更多的变异毒株。

岩鲷虹彩病毒（RBIV）会感染岩鲷，导致其脾细胞异常增大，最终导致整个鱼类种群死亡，对岩鲷养殖造成严重威胁。Jung 等[35]研究了添加角鲨烯、氢氧化铝和皂苷的灭活RBIV 疫苗的安全性和潜力。研究结果显示，3 种佐剂均能增强灭活病毒抗原的免疫原性，但只有皂苷不会引起任何明显的副作用，在添加皂苷的RBIV 疫苗组中，IL-1β、Mx、PKR 的转录水平显著提高，表明基于皂苷佐剂的RBIV 灭活疫苗可以为岩鲷提供针对该病毒的保护性免疫。

白景英等[36]对比了绞股蓝皂苷（GP）和经过磷酸化修饰的绞股蓝皂苷（pGP）体外抗鸭肝炎病毒（DHAV）的作用。试验结果表明，GP 和pGP均具有体外抗DHAV 作用；对DHAV 的基因序列测定发现，在病毒的吸附、复制、释放阶段，两种皂苷均对其有显著的抑制作用，而且pGP 效果要优于GP。研究结果表明，磷酸化修饰显著提高了GP 的抗DHAV 作用，因此pGP 有成为抗DHAV疫苗佐剂的潜力。

Wasin 等[37]研究了皂苷Quil A 与猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV-1）改性活病毒（MLV）疫苗共同给药，对IL-Ⅰ、IL-Ⅱ以及炎性细胞因子基因表达的影响。对于免疫后接种PRRSV-1 MLV 疫苗的小组，PRRSV 病毒血症猪的数量显著降低，平均日增重显著提高；对于皂苷Quil A 和PRRSV-1 MLV 疫苗共同给药的小组，干扰素调节因子3,2′-5′-寡腺苷合成酶1、IFNα、IFNβ、肿瘤坏死因子α 等的基因表达显著增加。试验结果表明，Quil A 上调了I型IFN 调节基因，I型和II型IFN以及炎症细胞因子的表达水平，还可以增强细胞对PRRSV 的免疫防御。

4 小结与展望

皂苷作为佐剂具有低毒性、高活性等显著优势，同时也存在细胞毒性、肝肾毒性等缺点。皂苷佐剂不仅能延长疫苗的免疫周期，减少接种次数，也能调控免疫相关基因的表达，使干扰素调节因子、肿瘤坏死因子等的基因表达水平显著上调，但具体通过什么路径达到调控免疫的作用机制还需要更多的研究。目前，皂苷佐剂在兽用疫苗中已经得到较广泛应用。随着皂苷疫苗佐剂研究的不断深入，越来越多的人用疫苗皂苷佐剂进入临床研究。国外含有QS-21 皂苷的疫苗就有15 个正在进行临床试验。这些疫苗的指征包括非小细胞肺癌、黑素瘤和疟疾等，其中4 种疫苗已进入III 期临床试验[38]。

我国植物资源丰富，拥有天然的药用植物宝库，现已经分离到较多的天然皂苷成分，但对于皂苷在疫苗中的应用研究，尤其是临床研究明显落后于美国等发达国家。今后的研究不能仅局限于天然皂苷资源的发掘和初步的药理药效学研究，更需要向高投入、高难度、高风险、高附加值的临床应用研究转变。一方面可以对天然皂苷的结构进行修饰，通过结构修饰达到减毒增效的目的；另一方面可以从制剂入手，开发新的剂型，或者新的给药方式与途径等，解决皂苷溶血性和细胞毒性等问题，使其在疫苗中的应用更加广泛。