泰州地区鸡白痢血清学调查及中药体外抑菌效果研究

刘玉华，林建鹏，刘滨华

（江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300）

鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌感染所引起的一类鸡细菌性传染病，各品种鸡均易感染，是对我国养鸡业危害较大的疾病之一。

雏鸡感染后主要表现排灰白色粪便，肠道充血、肿胀，发病率和死亡率较高，给养鸡场造成巨大的经济损失。成年鸡多为隐性感染，不表现临床症状，但长期携带病菌，并通过粪便向环境中排出病菌，通过粪便、垫料、空气、饮水、饲料等水平传播，成年鸡主要是生殖器官感染，可导致蛋鸡产蛋率下降，也可经种蛋垂直传播本病，出现死胚、死雏和弱雏。因此一旦鸡群发生本病，将给养鸡业带来严重危害。准确的了解鸡白痢流行情况，有利于及时采取有效的防控和净化措施，减少鸡白痢对养鸡业造成的危害。由于目前国内鸡场还未使用疫苗预防鸡白痢，因此可通过血清学调查了解鸡白痢的流行情况。中药防治鸡白痢与抗生素相比，具有不易产生耐药性，毒副作用小等优点。本研究旨在通过血清学方法调查泰州地区鸡白痢流行情况，分离出本地鸡白痢沙门氏菌流行株，并选取中药对所分离的鸡白痢沙门氏菌进行体外抑菌试验，为中药防治泰州本地鸡白痢沙门氏菌提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 病 料 疑似鸡白痢病死鸡病变的心脏、肝脏等。

1.1.2 培养基和主要试剂 麦康凯琼脂来自奥博星生物技术有限公司、生化反应管来自杭州天和微生物试剂有限公司。鸡白痢沙门菌多价血清型阳性血清来自北京中海动保科技有限公司。

1.1.3 中草药 黄芩、黄连、金银花、鱼腥草等购自本地药店。

1.1.4 仪器设备 恒温培养箱、冰箱、生物显微镜、高压蒸汽灭菌器、酒精灯、超净工作台等。

1.2 方 法

1.2.1 鸡白痢血清学调查 泰州地区5个鸡场，每个鸡场随机选取30只鸡，共150只鸡，每只鸡翅静脉采血1～2mL。3000 r/min离心10min，吸取上层血清作为待检血清进行平板凝集试验。吸取50μL鸡白痢凝集反应抗原垂直滴在玻璃板上，然后吸取50μL待检血清与鸡白痢凝集反应抗原充分混匀，2min内判定结果。出现50%以上凝集者判为阳性，不发生凝集者判为阴性，介于两者之间的判为可疑。同时设阳性对照组和阴性对照组。

1.2.2 细菌分离培养 取病料划线接种于麦康凯琼脂培养基表面，置于37℃温箱中培养24h，挑取疑似沙门氏菌的菌落（露滴状、灰白色菌落）接种到麦康凯琼脂培养基上进行纯化，观察长出的菌落特征。

1.2.3 革兰氏染色、镜检 接种环挑取纯化的疑似沙门氏菌落进行细菌涂片，革兰氏染色、镜检。革兰氏染色方法如下:（1）在已干燥、固定好的细菌涂片上，滴加草酸铵结晶紫染色液覆盖涂面，1min后水洗。（2）滴加革兰氏碘液覆盖涂面，1min后水洗。（3）滴加95%酒精覆盖涂面，0.5min后水洗。（4）滴加石炭酸复红覆盖涂面，0.5min后水洗。（5）用吸水纸吸干标本片，油镜镜检。

1.2.4 生化试验 挑取麦康凯琼脂上纯化的疑似单菌落接种到M-肉汤里37℃培养12h。吸取纯化菌落的培养物分别接种到葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、硫化氢、MR、VP、吲哚、枸橼酸盐等生化反应管内，放入37℃恒温箱中，培养24h，观察判断结果。

1.2.5 血清学鉴定 吸取50μL纯化菌落的培养物滴到玻璃板上，再吸取50μL鸡白痢沙门菌阳性血清与之充分混匀，在2min以内观察反应结果。出现明显的颗粒凝集者判为阳性。同时设置生理盐水阴性对照组。

1.2.6 体外抑菌试验 采用煎煮法分别提取黄连、黄芩、连翘、夏枯草、金银花、马齿苋中的有效成分，采用平板琼脂打孔法测定这6种中药对鸡白痢沙门菌的抑菌圈直径，比较这6种中药对鸡白痢沙门菌的体外抑菌效果。首先制备中药煎煮液，方法如下：6种中药分别称取50g，加入500mL蒸馏水，在室温下浸泡30min，然后煮沸，再文火煎煮，1h后煎煮液通过无菌纱布过滤，向滤渣中加入250mL水，加热至沸腾，煮沸30min，无菌纱布过滤，2次滤液合并在一起，在70℃水浴锅内浓缩到50mL，即可获得浓度为1g/mL的药液。药液装入容器内，流通蒸汽灭菌法灭菌30min,放入4℃冰箱保存备用。接着进行体外抑菌试验，即选用平板琼脂打孔法，测定中药抑菌圈的直径大小，方法如下：将菌液浓度调整到107～108CFU/mL，取0.1mL涂布于琼脂平板表面，待菌液被完全吸收，用打孔器进行打孔，每孔内滴加中药药液。37℃恒温箱培养12～16h，观察并且测量中药抑菌圈的直径。

判定标准：抑菌圈直径在10mm以下者为不敏感；10～15mm者为中敏；15mm以上者为高敏。

2 结果与分析

2.1 鸡白痢血清学调查鸡白痢血清学调查结果（见表1）显示，共检出阳性样品26份，鸡白痢平均阳性率为17.3%，表明泰州鸡场存在一定程度的鸡白痢沙门氏菌感染。

表1 鸡白痢血清学调查结果

统计不同养殖模式鸡场的血清学调查情况，结果（见表2）发现，1家林下散养鸡，30只鸡中检出阳性样品2份，鸡白痢阳性率为6.7%。2家平养鸡，60只鸡中检出阳性样品19份，鸡白痢阳性率31.7%。2家笼养鸡，60只鸡中检出阳性样品5份，鸡白痢阳性率为8.3%。表明平养鸡鸡白痢感染率较高，可能与平养鸡饲养密度大，鸡白痢沙门菌容易通过粪便、垫料等传播有关，所以平养鸡更要加强饲养管理，搞好环境卫生，做到严格消毒，以减少病原的传播，降低鸡白痢的阳性率。

表2 不同养殖模式下鸡白痢血清学调查结果

2.2 细菌分离鉴定结果对泰州地区5家鸡场现场调查，从疑似鸡白痢病死鸡中采集病料9份。通过从采集的病料中分离培养细菌、对分离的菌株进行革兰氏染色与镜检、生化鉴定，血清学鉴定，共分离鉴定鸡白痢沙门氏菌5株。为进一步研究本地致病性鸡白痢沙门氏菌株的特性，以采取更有针对性的措施防治本病奠定了基础。

2.3 体外抑菌试验结果选用6种中药对鸡白痢沙门氏菌进行体外抑菌试验，结果发现：鸡白痢沙门氏菌对黄芩、连翘、黄连3种药物高度敏感，抑菌圈直径分别为20.24mm，19.33mm，18.15mm。对夏枯草中度敏感，抑菌圈直径为13.73 mm。对金银花、马齿苋不敏感，抑菌圈直径分别为8.20mm、6.55mm。表明黄芩、连翘、黄连3种中药抑制鸡白痢沙门氏菌的效果较好，提醒当地兽医人员在防治鸡白痢时，可优先选择黄芩、连翘、黄连等抑菌效果好的中药，不建议选用金银花、马齿苋等，为临床用中药防治鸡白痢提供参考依据。

3 讨论与结论

当前，鸡白痢在许多鸡场普遍存在，在部分鸡场发病率较高，危害较大。如孙亮等对吉林省部分种鸡场进行血清流行病学调查，结果显示个体真实流行率为2.56%，董永毅等对江苏省部分地区进行鸡白痢血清学调查，结果显示平均阳性率达25.5%，李照伟等对贵州省部分规模化鸡场进行鸡白痢血清学调查，结果显示鸡白痢平均阳性率为83.87%。一些研究表明，用于防治鸡白痢沙门氏菌的抗生素存在一定程度的耐药现象，如王广泽等测定96株鸡白痢沙门菌分离株对9类21种抗菌药物的敏感性，结果显示所有鸡白痢沙门菌分离株均有不同程度的耐药现象。但另一方面，一些中药表现出了抑菌作用，如常超越等研究23种中药对鸡白痢沙门菌地方株S1、S2及标准株的体外抑菌试验效果，结果表明，鸡白痢沙门菌地方株S1、S2对黄芩、连翘、五倍子等8种药物极度敏感；对其他的中药存在不同程度的敏感性。

本研究通过采用鸡白痢平板凝集试验，对泰州地区鸡白痢感染情况进行血清学调查，结果显示鸡白痢平均阳性率为17.3%，统计不同养殖模式鸡场的血清学调查情况，结果发现，平养鸡场里鸡白痢阳性率最高为31.7%，为泰州地区防治鸡白痢提供了流行病学依据。从5家鸡场里疑似鸡白痢病死鸡病料中共分离鉴定鸡白痢沙门氏菌5株，选用6种中药对分离的鸡白痢沙门氏菌株进行体外抑菌试验，结果显示，鸡白痢沙门氏菌对黄芩、连翘、黄连3种药物高度敏感，抑菌圈直径分别为20.24mm、19.33mm、18.15mm。对夏枯草中度敏感，抑菌圈直径为13.73mm。对金银花、马齿苋不敏感，抑菌圈直径分别为8.20mm、6.55mm，根据体外抑菌结果指导临床合理选用中药防治鸡白痢，可以提高治疗效果，对提高养殖效益具有重要意义。

由于本病对幼雏致病强，死亡率高，又可垂直传播，给养鸡业带来严重损失，为减少本病的发生，应及时采取疫病净化及综合防治措施。如，定期调查本地鸡白痢的流行情况；对种鸡场加强检疫，对阳性鸡，及时淘汰；加强饲养管理，搞好环境卫生、消毒工作；选用合适的中药进行防治等。