龟龄集指纹图谱的建立及共有峰的LC-MS鉴定

史静超 ，高晓霞 ，张爱荣 ，秦雪梅 *

（1.山西中医药大学 中药与食品工程学院，山西 晋中 030619；2.山西大学 中医药现代研究中心，山西 太原 030006；3.山西广誉远国药有限公司，山西 太谷 030800）

0 引言

龟龄集是我国传统中药名方，始于明代嘉靖年间，历经400多年传承而不衰。2020版《中国药典》记载该方由红参、鹿茸、海马、补骨脂、甘草、天冬、淫羊藿等二十余味药材加工制成，具有强身补脑，固肾补气，增进食欲之功效［1］。现代药理和临床研究表明龟龄集可改善衰老引起的学习记忆功能障碍［2-3］，并可改善肾阳虚证［4］，对睾丸功能障碍具有保护作用［5-6］。

龟龄集的多种功效源于其物质基础，龟龄集组方由二十余味药材经炮制、升炼而成，药味多、生产工艺复杂，这都增加了龟龄集质量控制的难度。近年来，中药复方指纹图谱因其能够获得多维化学信息，并可得到标志复方特征的共有峰，而在中药复方质量控制方面应用广泛［7］。龟龄集产品一致性如何，怎样评价龟龄集产品的一致性和生产工艺的稳定性，目前尚无相关研究。基于此，本研究采用UPLC法对龟龄集进行测定，建立了龟龄集的UPLC指纹图谱，并对收集的15批次龟龄集样本进行了相似度评价。同时，采用LC-MS技术对龟龄集UPLC指纹图谱共有峰进行鉴定，以期为龟龄集质量控制提供科学依据。

1 仪器与材料

Waters ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱系统（美国Waters公司），UHPLC-Q Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱（美国Thermo公司），Milli-Q Advantage纯水-超纯水制备系统（美国Millipore公司）。

龟龄集（S1～S15批号依次为：20130201、20130302、 20141112、 20150101、 20150507、20151212、 103160203、 103160407、 103160508、103160917、103161018、 103170305、103170408、103170510、103170714，山西广誉远国药集团有限公司），补骨脂素（≥98%，批号：MUST-16092810）、新补骨脂异黄酮（≥98%，批号：MUST-16092810）和齐墩果酸（≥98%，批号：MUST-17042706）均购于成都曼斯特生物科技有限公司，甲醇、石油醚（60℃～ 90℃）为分析纯，乙腈为色谱纯。

2 研究方法

2.1 色谱和质谱条件

色谱条件：采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm；1.8 μm）色谱柱，流动相为乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1）；体积流量0.3 mL/min；进样体积2 μL；检测波长203 nm；柱温30℃。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution process

质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI），正负离子全扫模式，设置扫描质量范围为100 Da～1 500 Da，质量分辨率70 000，毛细管温度为320℃，加热器温度为300℃，鞘气流速为35 arb，辅气流速为10 arb，碰撞能量为25 V～60 V，采用快速数据依赖采集模式（DDA），对离子强度大于5 000的前驱离子进行MS/MS采集。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试样品制备

精密称取龟龄集样品1.0 g，置锥形瓶中加50 mL甲醇，超声提取30 min，将得到的溶液过滤，并将滤液浓缩至干，加30 mL水溶解残渣，以10 mL石油醚萃取3次，合并萃取液并浓缩至干，将残渣置2 mL容量瓶，以色谱甲醇溶解并定容，再用孔径0.22 μm微孔滤膜滤过即得。

2.2.2 对照品溶液制备

取适量补骨脂素、新补骨脂异黄酮、齐墩果酸，以色谱甲醇溶解，并定容至2 mL容量瓶，再用孔径0.22 μm微孔滤膜滤过即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

取同一批次龟龄集供试样品，按“2.1项”色谱条件连续进样6次，以11号峰为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间RSD＜0.13%，相对峰面积RSD＜1.53%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验

取同一批次龟龄集共6份，按照“2.2项”供试品制备方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1项”色谱条件进行测定，以11号峰为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间RSD＜0.10%，相对峰面积RSD＜1.02%，表明该方法的重复性良好。

2.3.3 稳定性试验

取同一龟龄集供试品溶液，按“2.2项”供试品制备方法制备供试品溶液，分别于0 h，4 h，8 h，12 h，16 h，24 h按“2.1项”色谱条件进行测定，以11号峰为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间RSD＜ 0.15%，相对峰面积RSD＜ 1.78%，表明供试品溶液在24 h内具有良好的稳定性。

3 研究结果

3.1 龟龄集UPLC指纹图谱的建立及相似度评价

3.1.1 指纹图谱的建立

按照“2.2项”的方法制备15批龟龄集供试品溶液，按“2.1项”色谱条件测定，记录每批龟龄集的UPLC图谱。15批样品各主要色谱峰保留时间基本一致，确定了该检测条件下峰面积较大、分离较好的19个峰为其共有色谱峰。其中11号峰与相邻峰分离良好，峰面积大且稳定性好，将其作为参照峰。将测得的15批样品指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》进行分析，得到共有模式对照指纹图谱R，如图1。

图1 龟龄集UPLC对照指纹图谱RFig.1 UPLC fingerprints of control fingerprint（R）

3.1.2 相似度评价

利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》对15批样品进行相似度评价，15批龟龄集UPLC指纹图谱叠加图见图2，15批样品及对照指纹图谱R的相似度计算结果见表2。由结果可知15批龟龄集样本间相似度大于0.820，和对照指纹图谱相似度均大于0.932，说明龟龄集产品生产工艺稳定，一致性良好。

图2 15批龟龄集样品UPLC指纹图谱叠加图Fig.2 UPLC fingerprints of 15 batches of Guilingji samples

表2 龟龄集指纹图谱相似度评价结果Table 2 Similarity evaluation on whole plant of Guilingji

3.2 龟龄集UPLC指纹图谱共有峰LC-MS鉴定

将供试品溶液按照“2.1”项下色谱和质谱条件进行测试。正负离子模式下的龟龄集样品和混合对照品的总离子流图见图3。采用Xcalibur 3.2软件分析得到的质谱数据，计算各共有峰对应化合物可能的化学式，并参照文献精确分子量和碎片离子鉴定了12个共有峰，其中1、3、13号峰经和对照品比对保留时间、精密分子量和碎片离子鉴定得到，鉴定结果见表3。

图3 正离子模式下龟龄集总离子流图（a），负离子模式下龟龄集总离子流图（b）和混合对照总离子流图（c）Fig.3 Total ion chromatograms(TIC)of Guilingji in positive mode(a);the total ion chromatograms(TIC)of Guilingji in negative(b),and the total ion chromatograms(TIC)of mixed references(c)

表3 龟龄集UPLC共有峰LC-MS化学成分鉴定Table 3 Identification of common peaks of Guilingji by LC-MS

4 分析与讨论

4.1 提取条件及色谱条件优化

由于龟龄集复方组成药味繁多，化学成分复杂多样，使得液相色谱中各峰的分离度差且峰面积小，为获得较多的化学信息和更好的分离度，实验考察了多种提取条件，包括100%甲醇、75%甲醇、50%甲醇、100%水回流、超声提取，发现峰分离较差，可能是由于龟龄集组方药味繁多，化学成分复杂导致峰重叠严重，故将甲醇提取物进行萃取，使用不同极性溶剂，包括石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，通过对比各种提取条件下UPLC图谱中总峰面积、总峰数和峰分离度，选择甲醇超声提取后再用石油醚萃取的条件。色谱条件优化了流动相系统及洗脱梯度，还考察了柱温包括25℃、30℃、35℃、40℃，发现在是用乙腈-水系统得到的峰更多，柱温在30℃时各峰对称性和分离度较好。采用光二极管阵列全波长扫描模式考察不同检测波长下的总峰数和峰面积，发现在203 nm处的峰数多且各峰均有较好的吸收。

4.2 龟龄集产品一致性和生产工艺稳定性评价

本研究建立的龟龄集UPLC指纹图谱，确定了19个共有峰，并计算了15批龟龄集产品的相似度，结果表明各批次样品相似度良好，虽然龟龄集制作工艺复杂，需将各单味药材经炮制再打粉混匀而后升炼制成，但其生产工艺稳定，产品一致性好。龟龄集UPLC指纹图谱共有峰LC-MS鉴定结果表明该指纹图谱中主要包括黄酮、香豆素、三萜和甾体类化合物。其中黄酮类化合物如新补骨脂异黄酮和corylifol A有良好的抗炎、抗氧化作用［13］，甘草查耳酮A亦可发挥抗炎和抗氧化的作用，其可能的机制是抑制NF-κB的激活和清除体外超氧阴离子自由基［14］。且黄酮类化合物可通过与大脑中负责记忆的细胞和分子相互作用来减少由于神经退行性过程造成的神经元损失，改善与年龄相关的认知障碍［15］。香豆素类化合物如补骨脂素、异补骨脂素也有良好的抗炎、抗氧化作用［13］，三萜类化合物如齐墩果酸可通过抗氧化、抗炎机制产生神经保护作用，并能抑制脑内11β-HSD1活性和β淀粉样肽的形成改善学习记忆障碍［16］。甾体类化合物如薯蓣皂苷元可通过改善氧化应激作用，降低Tau蛋白异常磷酸化等作用改善老年性认知功能障碍［17］。正是龟龄集组方中二十余味药材所含的化学成分协同作用才使得龟龄集具有强身补脑，固肾补气等多种功效。

综上，本研究首次建立了龟龄集UPLC指纹图谱，该方法简便、稳定、结果可靠，可用于龟龄集产品的一致性和生产工艺稳定性评价。同时，本研究建立的指纹图谱为龟龄集甲醇提取物的石油醚萃取部位，由LC-MS共有峰鉴定结果可知该指纹图谱主要反映龟龄集中所含的中、低极性成分，下一步研究还将针对龟龄集中高极性成分建立指纹图谱，以全面反映龟龄集化学组成，从而保证临床用药的安全性和有效性。