N,P-CDs用于Al3+和pH的检测及在细胞成像中的应用

闫娅楠 ，刘洋 ，刘竞 ，冯宁坤 ，宋胜梅 *，董川 *

（1.山西大学 化学化工学院，山西 太原 030006；2.山西大学 环境科学研究所，山西 太原 030006）

0 引言

目前，测定铝含量的方法有很多种，包括电感耦合等离子体光谱法［8］、高效液相色谱法［9］和电化学法［10］等。尽管这些方法在检测Al3+方面得到了广泛的应用，但是高昂的仪器设备和烦琐的前处理过程限制其方法的进一步推广［11-13］。因此渴望寻找一种更简便的方法来检测Al3+铝离子。pH值的测量方法，包括核磁共振（NMR）［14］，微电极［15］，吸收光谱法和荧光法［16］。其中，荧光测定法因其响应速度快、灵敏度高、无创性和实时监测而具有非凡的竞争优势［17］。荧光成像与激光共聚焦扫描显微镜（LSCM）相结合可以为监测活细胞的pH的变化提供高时空分辨率［18］。

碳点（carbon dots，CDs）［19］因其具有良好的光学性质［20］、生物相容性［21］和较低的生物毒性［22］等，已广泛应用于各种离子的检测、光学传感、荧光pH探针等领域［23-25］，是构建荧光传感方法中重要的碳纳米材料之一。例如，Li等［26］通过水热法合成了CDs，间接检测Al3+的存在。Fu等［27］通过电化学合成CDs用于检测水溶液中的Al3+。因此，开发制备简单、可直接检测Al3+的CDs备受关注。在pH的检测中，Guo等［28］通过一步水热法制备的CDs用于检测pH变化从1.00到3.00。Li等合成的CDs用于检测pH在5.00～10.00的变化。

目前，大部分的碳点在检测pH时主要集中在中性、极酸和极碱的体系中，而用于pH在4.00～6.00范围内检测的CDs少有报道，检测Al3+的方法多为间接检测。本文针对目前Al3+和pH检测中存在的问题，以对苯二胺为碳源，磷酸、乙二胺为磷和氮源，以微波法制备了N，P-CDs。该N，P-CDs可直接用于检测Al3+，选择性好，其线性范围为73.0 μmol/L～ 120.0 μmol/L，检测限为 21.03 μmol/L（S/N=3）。所制备N，P-CDs可在pH=4.00～6.00范围内灵敏地测定pH值，丰富了目前CDs用于检测pH值的方法，同时该N，P-CDs可以用于LSCM进行HeLa细胞内pH（4.00～6.00）的成像。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

试剂：对苯二胺、磷酸（H3PO4）和乙二胺购自美国西格玛奥德里奇贸易有限公司，硫酸铝、氯化钠、乙酸、硼酸、醋酸及香豆素307购自阿拉丁试剂有限公司。

主要仪器：Cary Eclipse荧光光谱仪（美国Varian公司）、Lambda 950型UV-Vis吸收光谱仪（英国兰特里森特珀金埃尔默公司）、Tensor II型傅里叶红外光谱仪（FTIR）（德国Bruker公司）、FLS920瞬态-稳态荧光光谱仪（英国Edinburgh公司）、FV1000型激光扫描共聚焦荧光显微镜（LSCM）（日本Olympus公司），Vario EL CUBE型元素分析仪（德国Elementar公司）、JEM-1011型透射电镜（TEM）（日本电子光学公司，JEOL）、AXIS ULTRA DLD型X-射线光电子能谱（XPS）（日本Kratos公司）、SunRise酶标仪（奥地利Tecan Austria GmbH公司）。

1.2 N,P-CDs的制备

在50 mL烧杯中分别加入0.108 1 g对苯二胺、195 μL磷酸、960 μL乙二胺。反应混合物在酸碱中和放热的作用下迅速反应。将其放入微波炉（1 000 W）中加热3 min 20 s，冷却后加入5 mL超纯水，超声使其溶解。将产物用滤纸和微滤膜（0.22 μmol·L-1）过滤除去大分子颗粒。之后置于烧杯中通过500 Da～ 1 000 Da的透析袋透析4 h，每2 h换一次二次水。最后将其冷冻干燥备用。

1.3 N,P-CDs荧光量子产率

以香豆素307（量子产率为0.56）为参比测定荧光量子产率。分别配制不同浓度的N，P-CDs溶液和香豆素307溶液，使用Lambda 950 UV-Vis吸收分光光度计测定各溶液在413 nm处的吸光度（保持吸光度值小于0.1，防止自吸效应［29］。使用Varian Cary Eclipse荧光计记录当激发波长为413 nm时的荧光光谱面积（选取418 nm～700 nm波长范围内荧光曲线下的面积积分）。然后绘制荧光积分面积与吸光度之间的曲线图，以（1）式计算荧光量子产率：

Φ、η和K分别表示量子产率、溶液的折射率和五点法的斜率；x和st分别表示样品和标准。

[37]人民网：《学汉语，原来含金量这么大》，http://www.hanban.edu.cn/article/2016-05/17/content_642047.htm，2016年5月17日。

1.4 N,P-CDs对Al3+的测定

为了确定N，P-CDs的选择性，适量金属离子盐溶解于10 mL超纯水得到16种0.1 mol/L的金属离子溶液。配制10 mg/mL的N，P-CDs溶液，加水得到略大于5 mg/mL的N，P-CDs，再加入微量0.1 mol/L的 HCl，以pH计测量，得到pH=4.5（保持Al3+不水解）的5 mg/mL的N，P-CDs工作溶液。

在N，P-CDs的选择性测定时，将金属离子（20 μL，0.1 mol/L）加入到2 mL N，P-CDs的工作溶液中，测量其荧光强度。为了评估其他金属离子对Al3+测定的干扰，通过将待测试离子（100 μL，0.1 mol/L）与2 mL的N，P-CDs工作溶液混合，进行荧光测量；随后，再加入一定量的Al3+（20 μL，0.1 mol/L）溶液，再测量荧光强度。测定Al3+时，先测量2 mL N，P-CDs工作溶液的荧光强度，然后将合适体积的0.1 mol/L Al3+加入工作溶液中，测量其荧光强度。

以荧光光谱仪记录激发波长为413 nm时，513 nm处发射波长的荧光强度，激发和发射狭缝均为10 nm，所有试验重复3次（没有特殊说明的荧光实验均采用此荧光条件）。

1.5 细胞毒性及成像实验

细胞毒性：将HeLa细胞接种到96孔板上，并在37℃、体积分数为5.0% CO2中培养24 h后，弃去上层液，给药孔中加入含不同浓度N，P-CDs（0、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5和 25 mg/mL）的溶液。孵育一段时间后，将孔板内的培养基换成MTT新鲜培养基（5 mg/mL），继续培养。最后，吸去上层液，加入二甲基亚砜，将所得混合物室温震荡10 min后，以酶标仪测量混合物的光密度（OD）［30］。

细胞成像：成像前，细胞先用10 mmol/L PBS（pH=7.40）冲洗3次；再在1 mL高K+缓冲溶液（120 mmol/L KCl、30 mmol/L NaCl、1 mmol/L CaCl2、0.5 mmol/L Mg2SO4、1 mmol/L NaH2PO4、20 mmol/L NaOAC、5 mmol/L葡萄糖和20 mmol/L HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸））和5 μg/mL的尼日利亚霉素存在下，将细胞与碳点孵育10 min，在不同pH值（4.00、4.30、4.70、5.00、5.30、5.70、6.00）下，在LSCM上进行细胞内pH荧光成像［28］。

1.6 实际样品检测

取实验室自来水作为实际样品进行检测。首先将自来水进行过滤，然后将自来水和5 mg/mL的N，P-CDs工作溶液等体积混合，以0.1 mol/L的HCl通过pH计调节pH=4.5；取2 mL溶液加入1 cm比色皿中，再加入不同体积的Al3+标准溶液，测量荧光强度；根据工作曲线计算Al3+的含量，并计算加标回收率。

2 结果与讨论

2.1 N,P-CDs的表征

元素分析数据结果表明N，P-CDs主要包括C、H、O、N和P五种元素，其质量分数分别为28.35%、6.76%、31.51%（计算值）、20.05%和13.33%，经计算N，P-CDs组成的经验式为C7H20O6N4P。以XPS对合成的N，P-CDs进行了表征。N，P-CDs的XPS总谱（图1（a））共分为五个峰，分别为131.3、191.5、283.4、397.7和528.6 eV，对应于P2p，P2s，C1s，N1s和O1s，确证了元素分析的结果。图1（b）中高分辨O1s谱分裂为四个峰，结合能分别为 529.02、529.64、530.22和 530.88 eV，对应于O-C-O、P=O、C-OH/C-O-C和P-O中的氧。图1（c）中的高分辨C1s谱分裂为五个峰，结合能分别为 284.29、284.87、285.52、286.10和 287.32 eV，对应于C=C、C-C/C-P、C-OH/C-O-C、C=N/C-P和C=O中的碳。高分辨的N1s（图1（d））分别在397.85、398.35、399.0和399.83 eV处分解成四个峰，分别与C-N-C、N-（C）3、吡啶N和吡咯N相关［28］。图1（e）显示的是P2p谱的分峰，分别是位于133.37 eV的P2p3/2和133.83 eV的PC。N，P-CDs表面的官能团以FTIR表征如图1（f）。2 855 cm-1为C-H伸缩振动峰，2 500 cm-1～2 760 cm-1为P-OH的弯曲振动，C=N拉伸以及-CH3的弯曲振动分别对应1 569 cm-1和1 477 cm-1处。P-O-H、P-O-C和氢键型P=O分别在 960 cm-1、1 076 cm-1和 1 367 cm-1处［31］。这些实验数据证明N和P被成功掺杂进所制备的CDs中。

图1 （a）N，P-CDs的XPS总谱和高分辨（b）O1s谱；（c）C1s谱；（d）N1s谱和（e）P2p谱；（f）FTIR谱Fig.1 (a)XPS survey and high resolution spectrum of N,P-CDs(b)O1s,(c)C1s,(d)N1s,(e)P2p and(f)FTIR spectrum of N,P-CDs

所制备N，P-CDs的形貌和粒径如图2所示。图2（a）表明纳米颗粒呈球形或准球形，分散比较均匀，没有明显的团聚，图2（b）表明粒径分布范围为1 nm～2 nm，粒径分布较窄，平均粒径为1.35 nm。高分辨图谱没有取到明显的晶格条纹，说明所制备CDs为无定型，无明显的晶格结构。

图2 （a）N，P-CDs的TEM和（b）粒径分布图Fig.2 (a)TEM image and(b)the diameter distribution of N,P-CDs

2.2 N,P-CDs的光学性质

N，P-CDs的UV-Vis吸收光谱图（图3（a），蓝线）有分别位于240 nm和300 nm的两个吸收峰，分别对应于苯环结构的sp2杂化区域的π→π*跃迁和C=O键的n→π*跃迁，此外，在400 nm处有弱的宽吸收带，可归因于能量较低的官能团的电子跃迁。图3（a）中左边和右边的插图分别为自然光和365 nm激发下N，P-CDs溶液的颜色。图3（a）中的红线和黑线表明N，P-CDs的最大激发和发射波长分别为413 nm和513 nm，图3（b）为N，P-CDs在340 nm～440 nm激发波长下的荧光发射光谱，当激发波长从340 nm变化到440 nm（间隔10 nm）时，发射波长变化不显著。以香豆素307为标准，通过（1）式计算得N，P-CDs的相对量子产率为2.6%。

图3 （a）N，P-CDs的紫外可见吸收（蓝线）和荧光（红线激发，黑线发射）光谱；（b）不同激发波长下N，P-CDs的荧光发射光谱。图a中插图是自然光（左）和365 nm紫外灯（右）照射下N，P-CDs溶液的颜色Fig.3 （a）UV-Vis absorption（blue line）and fluorescence spectra（red line and black line are excitation and emission spectrum，respectively.）of N，P-CDs.（b）Fluorescence spectra of N，P-CDs at different excitation wavelengths

进一步考察了N，P-CDs的荧光稳定性。图4（a）表明当KCl溶液的体积浓度在0～ 4 mol/L范围内时，N，P-CDs在513 nm处的荧光强度变化较小，说明即使在较高的离子强度下，其荧光强度依然稳定，因此所合成的N，P-CDs可用于生物体中。氙灯照射160 min后，N，P-CDs的荧光强度几乎恒定（图4（b）），说明N，P-CDs溶液的抗光漂白能力强。不同pH对N，P-CDs的荧光强度的影响如图4（c），当溶液的pH值从1.00→8.00时，N，P-CDs的荧光强度随pH的增大而增强；当pH值从8.00→13.00时，荧光强度随pH的增大而减弱；在pH值4.00～6.00区间内荧光强度发生突变。因此，进一步考察了pH在1.00～8.00区间内对N，P-CDs荧光强度的影响。图4（d）为不同pH下的荧光滴定曲线，以Boltzmann函数模拟得到图4（e）所示的拟合曲线，得N，P-CDs的pKa=4.91，说明表面含有弱酸性官能团，这与FTIR谱上有以NH3+形式存在的氮一致。从N 1s XPS光谱中，氮原子也以吡啶N和吡咯N的形式存在。N，P-CDs的pH敏感性可归因于其表面吡咯N、吡啶N和NH2的部分质子化及去质子化。另外，可逆性是pH荧光探针的一个重要标准。使用浓盐酸和氢氧化钠调节N，P-CDs的pH在1.00～7.00之间波动来考察它的可逆性，如图4（f）所示。结果表明，此过程完全是可逆的。说明，N，P-CDs对pH的响应具有高度可逆性。

图4 （a）不同浓度KCl溶液对N，P-CDs荧光强度的影响；（b）N，P-CDs的光稳定性测试；（c）pH对N，P-CDs荧光强度的影响；（d）不同pH条件下N，P-CDs的荧光图谱；（e）513 nm处的pH依赖性荧光强度的Sigmoidal/Boltzmann拟合。插图显示了N，P-CDs在pH（4.00～ 6.00）的线性关系；（f）N，P-CDs在pH=1.00～ 7.00之间荧光可逆变化Fig.4 (a)Effect of different concentrations of KCl on the fluorescence intensity of N,P-CDs.(b)Photostability of N,P-CDs excited at Xenon arc lamp for 160 min.(c)Effect of pH on the fluorescence intensity of N,P-CDs.(d)Fluorescence spectra of N,P-CDs in various pH value.(e)Sigmoidal/Boltzmann fitting of pH-dependent fluorescence intensity at 513nm.The inset displays the linear plot of N,P-CD against pH(4.00-6.00).(f)Fluorescence reversible response against pH varied repeatedly between 1.00 and 7.00

2.3 荧光方法检测Al3+

图5（a）表明大部分金属离子对N，P-CDs的荧光强度没有明显影响，而Al3+对N，P-CDs的荧光猝灭程度较大，即所制备的N，P-CDs对Al3+有良好的选择性。另外，考察了其他金属离子存在时该N，PCDs抗干扰的能力（图5（b）），当溶液中存在Al3+浓度10倍的其他金属离子时，显示对Al3+检测并没有明显的干扰，说明N，P-CDs能够选择性识别Al3+而不受常见金属离子的干扰。图5（c）描述了在不同浓度的Al3+存在下N，P-CDs荧光强度的变化。同时在 73 μmol/L～ 120 μmol/L范围内Al3+的浓度与F/F0有良好的线性关系，检出限为21.03 μmol/L（S/N=3）。如图5（d）所示。不同参考文献中的CDs的制备方法及对Al3+的检测对比如表1。由表可见，我们制备CDs的方法用时较短，方法简便，节省能源；且所制备CDs可以直接响应Al3+，不需用间接的方法测定。参考文献中间接方法测定Al3+时，在确定可准确检测Al3+的最低浓度时是有困难的，需要多次试验，反复测定以后才能准确确定，不如直接测定方法快捷。

图5 （a）5 mg/mL N，P-CDs中加入20 μL，0.1 mol/L不同金属离子后的荧光强度；（b）N，P-CDs检测Al3+的抗干扰测试（黑条表示在N，P-CDs溶液中添加了金属离子（100 μL，0.1 mol/L）。红条表示随后将Al3+（20 μL，0.1 mol/L）添加到N，P-CDs溶液中）；（c）5 mg/mL N，P-CDs在不同浓度Al3+存在时的荧光发射光谱；（d）F/F0与Al3+浓度的关系Fig.5 (a)Fluorescence intensity of 5 mg/mL N,P-CDs in the presence of different metal ions(20 μL,0.1 mol/L).(b)N,P-CDs detection Al3+ anti-interference test(The black bars represent the addition of other metal ions(100 μL,0.1 mol/L)to N,P-CDs solution.The red bars represent the subsequent addition of Al3+(20 μL,0.1 mol/L)to N,P-CDs solution).(c)Fluorescence emission spectra of N,P-CDs upon addition of various concentrations of Al3+.(d)The relationship between F/F0 and Al3+concentration

表1 不同方法制备的CDs用于检测的比较Table 1 Comparison of CDs prepared by different methods for the detection of Al3+

为了阐明Al3+猝灭N，P-CDs的荧光的机理，分别测定了N，P-CDs和N，P-CDs中加入120 μmol/L Al3+后的荧光寿命（图6（a）），计算出N，P-CDs和N，P-CDs/Al3+平均寿命分别为3.51 ns和3.81 ns，显示Al3+加入后N，P-CDs的荧光寿命基本没有发生明显的变化，说明Al3+以静态猝灭的方式猝灭了N，P-CDs的荧光。紫外滴定光谱如图6（b）所示，随着不同浓度的Al3+的加入，在498 nm左右出现了新的吸收峰，可能Al3+与N，P-CDs形成了复合物。比较N，P-CDs（图2（f））与N，P-CDs中加入Al3+的FTIR图6（c）可明显看出，加入Al3+后N，P-CDs的峰位置和峰强度均发生了变化，表明荧光猝灭可能是由于Al3+与N，P-CDs表面的基团发生了配位，这与静态猝灭的结果一致。

图6 （a）5 mg/mL N，P-CDs和在120 μmol/LAl3+存在时N，P-CDs的荧光寿命；（b）不同浓度Al3+存在时N，P-CDs的UV-Vis吸收光谱图；（c）加入Al3+后N，P-CDs的FTIR图Fig.6 (a)Fluorescence lifetime of 5 mg/mL N,P-CDs and N,P-CDs in the presence of 120 μmol/LAl3+.(b)UV-Vis absorption spectra of the N,P-CDs and in the presence of different concentrations of Al3+.(c)FTIR spectra of N,P-CDs and N,P-CDs in the presence of Al3+

2.4 实际样品中Al3+的测定

以所建立新的分析方法对实际水样中Al3+含量进行了加标回收率实验（表2）。误差分析基于95% 置信度的t分布（t0.05，5=2.57）函数的双边检验。在实际样品中没有检测到Al3+的存在。从表2得出，在自来水中检测到的Al3+浓度与加入的浓度基本一致，回收率在95.0%～102.5%之间，相对标准偏差在1.40%～2.30%之间。此方法可以用于实际样品中Al3+的检测。

表2 自来水中Al3+的测定Table 2 Determination of Al3+ in tap water samples

2.5 N，P-CDs的细胞毒性及细胞成像

选用HeLa细胞作为模型细胞，以MTT法测定N，P-CDs的细胞毒性（图7）。不同浓度N，P-CDs与细胞孵育24 h后，即使N，P-CDs的浓度达到12.5 mg/mL时，HeLa细胞的成活率仍然比较高，基本都在90%以上，表明N，P-CDs对细胞表现出较低的毒性，表明细胞成像的可行性。

图7 不同浓度的N，P-CDs对HeLa细胞的毒性测定Fig.7 Cell viability(%)of HeLa cells after 24 h treatment with different concentration of N,P-CDs calculated from MTT assay

图8为不同 pH（4.00、4.30、4.70、5.00、5.30、5.70、6.00和7.40）下5 mg/mL的N，P-CDs标记的HeLa细胞的荧光成像结果。由图可见，N，PCDs可进入HeLa细胞质，发出绿色荧光且细胞仍保持良好的形态，表明了N，P-CDs的良好生物相容性。随着pH由4.00增加到7.00，荧光强度逐渐增强，并在pH=7.00时荧光达到最强。因此，N，P-CDs具有在活细胞内检测pH的潜在应用价值。

图8 HeLa细胞与N，P-CDs孵育后的LCSM图。第一列为明场图；第二列暗场图；第三列为叠加场图（pH=4.00，4.30，4.70，5.00，5.30，5.70，6.00和7.00）Fig.8 Fluorescence imaging of HeLa cells treated with N,PCDs.（a）bright field,（b）dark field,（c）overlay images of（a,b）（pH=4.00,4.30,4.70,5.00,5.30,5.70,6.00 and 7.00）

3 结论

本文以对苯二胺、磷酸、乙二胺为原料以微波法合成了N，P-CDs，基于荧光静态猝灭的机理，构建了一种绿色荧光纳米探针识别Al3+的检测方法。该探针在 Al3+浓度 73.0 μmol/L ～ 120.0 μmol/L的范围内具有良好的线性关系。同时该碳点在pH 4.00～6.00范围内可灵敏地检测pH值。MTT分析结果表明，N，P-CDs具有很好的生物相容性和低的生物毒性，可应用于细胞成像，为环境和生物传感应用提供了一种新方法。