老翘HPLC特征图谱研究

元昕，王姝君，唐建开，张立伟

（山西大学 分子科学研究所 化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西 太原 030006）

0 引言

连翘为木樨科植物连翘（Forsythia suspensa（Thnub.）Vahl）的干燥果实，主产于山西、陕西、河南、河北等地，具有清热解毒、消肿散结之功效，主治温热、丹毒、斑疹、疮疡肿毒、瘰疬等证。根据采收期不同，连翘分为青翘和老翘两种规格，秋季果实初熟尚带绿色时采收，除去杂质，蒸熟，晒干，习称“青翘”；秋季果实熟透时采收，晒干，除去杂质，习称老翘［1］。连翘主要含有苯乙醇苷类、木脂素类和黄酮类等化学成分［2-5］。现行《中华人民共和国药典：一部》（2020年版）在连翘项下收载了青翘和老翘两种规格，并在性状、鉴别、浸出物、挥发油含量、连翘酯苷A和连翘苷含量等方面做出了规定，但以此来评价连翘饮片的质量尚存在一定程度的不完整性［6-8］。近年来中药特征图谱作为中药质量控制的补充检测方法，愈来愈受到研究工作者的重视［9-12］，因此，为了比较全面的控制青翘的质量，已有较多的学者对青翘的指纹图谱或特征图谱进行了比较充分的研究［13-14］，为进一步完善青翘的鉴别和质量评价提供了依据和方法。目前尚未见到有关老翘特征图谱的研究报道，从真伪性、准确度把握老翘质量标准会有所不足，为了更好地控制老翘饮片品质，可以利用中药特征图谱考察老翘化学成分以及各成分之间的差异，比较科学地控制老翘饮片质量，据此，本文利用高效液相色谱建立老翘特征图谱，分别指认了梾木苷甲基醚、芦丁、连翘酯苷A、连翘苷、连翘脂素5个特征成分，为进一步完善老翘的鉴别及质量评价提供依据。

1 仪器与材料

高效液相色谱仪（Agilent 1260 II，美国Agilent公司）；Agilent Zorbax C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；万分之一天平（OHAUS CP114型，奥豪斯上海仪器公司）；超声波扫描清洗机（SB-3200 DTS型，宁波新芝生物科技公司）；十万分之一天平（EX125DZH型，奥豪斯常州仪器公司）。

连翘酯苷 A（98%，批号MUST-20032804，成都曼思特生物科技有限公司），连翘脂素（98%，批号MUST-19061710，成都曼思特生物科技有限公司），连翘苷（99%，批号MUST-19070810，成都曼思特生物科技有限公司），梾木苷甲基醚（96%，江苏永健医药科技有限公司提供），芦丁（99%，批号：101625，江苏永健医药科技有限公司），色谱纯甲醇、乙腈、冰醋酸（美国Fisher公司），其他试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。老翘来自药材市场和山西连翘基地共12批，捡除杂质，筛去种子。经山西大学分子科学研究所张立伟教授鉴定为木樨科连翘属植物连翘（Forsythia suspensa（Thnub.）Vahl）的成熟干燥果壳。样品来源信息见表1。

表1 样品来源Table 1 Origins of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为 Agilent Zorbax C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.4%冰醋酸（B），梯度洗脱（0～ 13 min，13%A→16%A；13 min～23 min，16%A；23 min～ 33 min，16%A→21%A；33 min～ 45 min，21%A→28%A；45 min～ 63 min，28%A→45%A），流速0.8 mL·min-1，柱温25 ℃，进样量10 μL，检测波长280 nm。

2.2 溶液配制

2.2.1 混合对照品溶液

分别精密称取梾木苷甲基醚、连翘酯苷A、连翘苷、连翘脂素和芦丁对照品9、15、6、2、4 mg置于10 mL容量瓶中，用70%甲醇溶液溶解定容至刻度，得到混合标准溶液，其中梾木苷甲基醚浓度为0.9 mg/mL，连翘酯苷A浓度为1.5 mg/mL，连翘苷浓度为0.6 mg/mL，连翘脂素浓度为0.2 mg/mL、芦丁浓度为0.4 mg/mL。

2.2.2 供试品溶液

准确称取老翘药材（过3号筛）约0.5 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入15 mL体积分数为70%甲醇溶液，称重，超声处理30 min，待冷却至室温后，用70%甲醇溶液补足失重，摇匀取上清，用0.45 μm的微孔滤膜过滤即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度实验

称取S1样品，按上述方法制备供试品溶液，并连续进样6次，生成色谱图。参照峰设置为连翘酯苷A（3号峰），并对本文标定的5个特征峰的相对峰面积及相对保留时间进行计算，结果显示5个特征峰相对峰面积、相对保留时间的RSD分别小于2.42%、0.18%，均符合要求（RSD＜ 5%），表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性实验

称取S1样品共6份，平行制备6份供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，生成色谱图，参照峰设置为连翘酯苷A（3号峰），并对本文标定的5个特征峰的相对峰面积及相对保留时间进行计算，结果显示5个特征峰相对峰面积、相对保留时间的RSD分别小于2.27%、0.13%，均符合要求（RSD＜5%），表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性实验

称取S1样品，并按本文方法制备供试品溶液，分别于 0，4，8，12，24 h注入高效液相色谱仪中，生成色谱图，参照峰设置为连翘酯苷A（3号峰），并对本文标定的5个特征峰的相对峰面积及相对保留时间进行计算，结果显示5个特征峰相对峰面积、相对保留时间的RSD分别小于2.28%、0.15%，均符合要求（RSD＜ 5%），说明样品溶液在24 h内基本稳定。

2.4 特征图谱

2.4.1 特征图谱的建立

取12批老翘样品粉末，制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件测定。利用2012版“中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统”进行相似度分析，以S1样品的色谱图作为参照图谱，并将S2～S12样品的色谱峰与S1样品的色谱图进行自动匹配，生成对照图谱（R），结果如图1所示。选择共有的主要色谱峰为特征峰，并与对照品比对，确定峰1为梾木苷甲基醚，峰2为芦丁，峰3为连翘酯苷A，峰4为连翘苷，峰5为连翘脂素，如图2所示。

图1 老翘特征图谱S1-S12：12批老翘药材特征图谱R：对照特征图谱Fig.1 Characteristic chromatograms of ripe F.suspensaS1-S12：The characteristic chromatograms of 12 batches of ripe F.suspensa,R：control characteristic of the chromatogram

图2 对照品色谱图1：梾木苷甲基醚；2：芦丁；3：连翘酯苷A；4：连翘苷；5：连翘脂素Fig.2 HPLC chromatogram of mixed reference substances1:suspensaside methyl ether,2:rutin,3:forsythoside A,4:phillyrin,5:phillygenin

2.4.2 特征峰相对保留时间的确定

将12批老翘样品按“2.1”项下的色谱条件进行分析，参照峰设置为连翘酯苷A（3号峰），分别计算梾木苷甲基醚、芦丁、连翘酯苷A、连翘苷、连翘脂素的相对保留时间。结果显示各特征峰相对保留时间均在规定值的±5%之内，规定值分别为：0.85（峰 1）、0.89（峰 2）、1.00（峰 3）、1.67（峰 4）、2.22（峰5）。以连翘酯苷A为参照峰，分别标定芦丁、梾木苷甲基醚、连翘苷以及连翘脂素的相对保留时间，数据见表2。

表2 老翘各特征峰的相对保留时间Table 2 The relative retention time of each characteristic peak of ripe forsythia suspensa

2.4.3 老翘药材特征图谱相似度分析

将12批老翘样品的色谱图导入2012版“中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统”进行相似度分析，计算得到12批样品与对照特征图谱的相似度分别 为 0.926、0.906、0.961、0.978、0.981、0.947、0.949、0.959、0.971、0.921、0.921、0.973，表明各产地老翘饮片具有较高的相似性。

3 讨论

3.1 提取条件确定

首先对提取溶剂进行考察，分别比较乙醇、甲醇、水等溶剂对样品的提取效果，最终确定以甲醇作为提取溶剂，并对不同浓度甲醇提取效果进行了比较，发现70%甲醇（体积分数）作为提取溶剂时提取效率最高；其次，对提取方式进行了考察，分别比较了超声提取法和加热回流提取法的提取效率，确定以超声提取法作为提取方法更为简便，效率更高。

3.2 流动相选择

分别对甲醇-0.4%醋酸水、乙腈-0.4%醋酸水、乙腈-水等流动相体系进行考察，并对该流动相的梯度洗脱时间进行考察，结果显示流动相体系为乙腈-0.4%醋酸水时，各色谱峰分离效果较好且基线平稳；并以制备样品色谱图基线平稳、色谱峰信息量大，特征性强为依据确定本实验的梯度体系。

3.3 检测波长选择

在老翘特征图谱中，对235、280和330 nm三个波长进行检测，结果显示，在波长280 nm时，色谱图基线平稳且供试品主要成分的分离度较好，色谱峰信息量大，紫外吸收峰强度较高，因此将280 nm作为特征图谱的检测波长。

3.4 特征峰选择

老翘中主要含有苯乙醇苷类、木脂素和黄酮类成分，因此，本文分别选取了三类成分中具有代表性和特征性的连翘酯苷A、梾木苷甲基醚、连翘苷、连翘脂素和芦丁作为老翘特征图谱的特征峰。在连翘药材中，连翘酯苷A的含量较高，活性较好，且该峰在本文的条件中分离度和稳定性均符合要求，所以将连翘酯苷A作为老翘特征图谱的参照峰。此外，由于梾木苷甲基醚在老翘的甲醇提取物中含量较高，因此，本文建立的老翘特征图谱与研究报道的青翘特征图谱的最大区别在于增加了梾木苷甲基醚特征峰。

4 结论

本实验通过HPLC法优化了老翘特征图谱的条件，并通过对照品对照法确认了老翘甲醇提取物中梾木苷甲基醚、芦丁、连翘酯苷A、连翘苷、连翘脂素等5个特征成分，并对所建立的方法进行了精密度、稳定性和重复性等方法学考察，结果证明该方法有效可行。并对12批老翘样品的特征图谱进行特征峰相对保留时间与相似度分析，结果表明12批老翘的相似度可达到0.900以上，证明这12批老翘药材具有较高的相似性，且5个特征峰重复性、专属性好。本研究建立的老翘特征图谱可以为评价老翘质量标准提供很好的依据。