一种玉米种子细菌性病原菌的鉴定及其防治药剂筛选

吴之涛，常 浩，李文学，杨克泽，马金慧，徐志鹏，汪亮芳，任宝仓

(1.甘肃省农业工程技术研究院，甘肃武威 733006；2.甘肃省特种药源植物种质创新与安全利用重点实验室，甘肃武威 733006；3.甘肃省玉米病虫害绿色防控工程研究中心，甘肃武威 733006；4.武威市玉米病虫害绿色防控技术创新中心，甘肃武威 733006)

玉米(ZeamaysL.)属禾本科玉蜀黍属一年生草本植物，原产于墨西哥和中南美洲其他国家，因其具有良好的适应性在热带和温带地区广泛种植，是全球重要的粮食作物之一。在中国，玉米不仅是重要的粮饲兼用型作物，同时也是重要的化工原料，种植面积和总产量居四大主粮作物之首，在现代农业产业结构中具有极其重要的地位。因此，玉米的安全生产对于保障国家粮食安全、食品安全、能源安全等都具有重要意义[1-2]。近年来，随着农业种植产业结构的调整，玉米种植区域范围不断扩大、品种更替加快、气候变化异常及耕作栽培模式转变使玉米生产中面临的病虫害胁迫问题日益凸显，严重影响玉米产业的健康高质量发展[3]。迄今为止全世界报道的玉米侵染性病害有185种，其中细菌性病原侵染的病害仅有20种[4]，在国内报道的玉米细菌病害主要有Acidovoraxavenaesubsp.avenae引起的细菌性条斑病[5]、Bacillusmegaterium引起的细菌性叶斑病[6]、Pseudomonassyringaepv.syringaeVan Hall引起的细菌性褐斑病[7]、Pseudomonasaeruginosa引起的细菌性茎腐病[8]、Pantoaeagglomerans引起的细菌性干茎腐病[9]等。目前关于玉米细菌性病害的研究报道相对较少，细菌性病害具有发病迅速、传播速度快等特点，往往给农业生产造成严重损失。甘肃省张掖市是全国最大的杂交玉米种子生产基地，制种面积常年维持在6.7万hm2左右，种子产业已逐渐成为当地助力脱贫攻坚，带动农民增收的重要支柱产业[10]。2020年6月，在部分制种田发现整株玉米矮化皱缩，叶片卷曲，沿叶脉两侧出现不规则油渍状褪绿条斑，发病部位叶片组织发白变薄，发病较重的生长点组织坏死，部分茎髓组织缺失，形成不规则缺刻，心叶缺失或呈筒状，植株生长点部位弯曲，部分病株出现分蘖。经初步调查田间平均发病率在50%左右，严重时甚至绝产。为明确该病害的病原，本试验收集发病植株玉米种子，对种子胚芽组织和种植的幼苗心叶生长点组织进行病原菌分离，结合致病性测定、病原菌形态特征、培养性状、生理生化特征及16S～23S rDNA间隔区序列比对分析对分离的病原菌进行鉴定，并采用抑菌圈法对5种杀菌剂进行室内毒力测定，筛选出抑菌效果较好的药剂，以期为该病害的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料：玉米种子，品种为‘N70’。

NA培养基：牛肉浸膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂18 g、蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.2；KB培养基：胰蛋白胨20 g、K2HPO41.5 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、甘油15 mL、琼脂15 g、蒸馏水定容至1 000 mL；LB液体培养基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、蒸馏水定容至 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

结晶紫染剂，溶液Ⅰ：结晶紫2.0 g，乙醇(95%)20 mL；溶液Ⅱ：草酸铵0.8 g，蒸馏水80 mL。碘液：碘1.0 g、碘化钾2.0 g，蒸馏水300 mL。复染剂：2.5%番红乙醇溶液20 mL，蒸馏水80 mL。氧化酶试剂：1%盐酸四甲基对苯撑二胺。接触酶试剂：3%～10%过氧化氢。1%溴百里酚蓝水溶液：先用少量95%乙醇溶解，再加蒸馏水配成1%的水溶液。格里斯试剂，溶液Ⅰ：对氨基苯磺酸0.5 g，稀醋酸(10%左右)150 mL；溶液Ⅱ：α-萘胺0.1 g、蒸馏水20 mL，稀醋酸(10%左右)150 mL。碳素化合物：D-半乳糖、海藻糖、D-甘露糖、D-果糖、蔗糖、L-阿拉伯糖、麦芽糖、D-纤维二糖；1%盐酸四甲基对苯撑二胺、溴百里酚蓝、对氨基苯磺酸、α-萘胺、D-半乳糖、海藻糖、D-甘露糖、D-纤维二糖、L-阿拉伯糖购于Takara公司。其他试剂购于天津市凯通化学试剂有限公司。

分子生物学试验试剂及仪器：Mix(含MgCl2)，DNA Marker购于生工生物工程(上海)股份有限公司；T100 PCR仪及凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司；721分光光度计，日本岛津仪器公司；Ni-U显微镜，日本Nikon公司。

供试杀菌剂：10%中生·寡糖素可湿性粉剂，江苏明德立达作物科技有限公司；47%春雷·王铜可湿性粉剂，江门市植保有限公司；3%噻霉酮可湿性粉剂，陕西西大华特科技实业有限公司； 0.3%四霉素水剂，辽宁微科生物工程股份有限公司；2%春雷霉素水剂，江门市植保有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 病原细菌的分离纯化 将玉米种子(品种为‘N70’)先用体积分数75%的乙醇溶液表面消毒处理5 min，再用3% NaClO水溶液表面消毒处理5 min，最后用无菌水冲洗3次，然后加入适量 0.01 mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH为7.2)在 4 ℃无菌条件下浸泡12 h。用无菌手术刀切取大小为3 mm×3 mm的胚芽组织块置于加有300 μL灭菌水的白瓷板中充分研磨，用灭菌环蘸取研磨液在NA平板上划线分离，置于光照培养箱中在28 ℃下培养48 h，挑取形态大小一致的单菌落进行纯化，将纯化的菌株在NA和KB培养基上培养72 h后，观察菌落形态大小、颜色、表面光滑度。

玉米种子(品种为‘N70’)经3%NaClO水溶液表面消毒处理10 min后，用无菌水冲洗3遍，播种于装有灭菌营养土的花盆中(d=30 cm)，待玉米长出4～5片真叶后，采集矮化皱缩植株的心叶生长点组织进行病原分离。幼苗心叶生长点组织用体积分数75%的乙醇溶液表面消毒处理 1 min，无菌水冲洗3次，用灭菌手术刀切取大小为5 mm×5 mm的组织块置于加有300 μL灭菌水的白瓷板中充分研磨，用灭菌环蘸取研磨液在NA平板上划线分离，置于光照培养箱中在28 ℃下培养48 h，挑取形态大小一致的单菌落进行纯化，将纯化的菌株在NA和KB培养基上培养 72 h后，观察菌落形态大小、颜色、表面光滑度。

1.2.2 致病性测定 将“1.2.1”中纯化的菌株挑取单菌落接种于装有LB液体培养基的三角瓶中，在28 ℃、200 r/min条件下摇培24 h，制成菌液悬浮液。用分光光度计测定菌液悬浮液OD600nm的吸光度值，当数值达到0.3时，细菌悬浮液的浓度为3×108CFU/mL，备用。

玉米种子(品种为‘N70’)经3%NaClO水溶液表面消毒处理10 min后，用无菌水冲洗3遍，将种子置于恒温干燥箱内(温度为65 ℃)干热消毒1 h，播种于装有灭菌营养土的花盆中(d=30 cm)，每盆播种20粒，置于相对湿度65%～75%、温度15～25 ℃、自然光照的日光温室中进行培养。当玉米长到4～5片真叶时进行间苗，剔除弱苗，每盆保留10株长势一致的植株进行致病性测定。采用喷雾法接种，用无菌喷壶将浓度为3×108CFU/mL的细菌悬浮液均匀喷洒在玉米叶片上，每盆喷10 mL，以喷等量无菌水作为对照，每个菌株接种30株，接种后套袋保湿培养，3 d后观察植株发病情况。

1.2.3 病原细菌生理生化特征测定 参照常见细菌系统鉴定方法[11-12]对分离纯化的病原细菌菌株分别进行革兰氏染色试验、荧光产生试验、烟草过敏反应试验、氧化酶试验、接触酶试验、41 ℃下生长试验、耐盐性试验、马铃薯腐败试验、淀粉水解试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验、H2S产生试验及对D-半乳糖、海藻糖、D-甘露糖、D-果糖、蔗糖、L-阿拉伯糖、麦芽糖、D-纤维二糖等碳源的利用试验，每个菌株3次重复。

1.2.4 病原细菌分子生物学鉴定 选取从玉米种子胚芽组织和幼苗心叶生长点组织分离纯化的细菌菌株进行分子生物学鉴定。采用CTAB法[13]提取细菌菌株基因组DNA，利用植物病原细菌16S～23S rDNA间隔区序列的通用引物L1：5′-AGTCGTAACAACGTAGCCGT-3′和L2：5′-GTGCCAAGGCATCC-ACC-3′对细菌菌株基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应体系(25 μL)为：引物L1和L2各1 μL，细菌菌株基因组DNA 1 μL，Mix(含MgCl2)12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR扩增条件为：95 ℃预变性300 s； 94 ℃变性30 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸600 s。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，之后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。登录NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)将测序结果与GenBank中相关核苷酸序列进行BLAST比对，利用MEGA5.0软件(最大似然法Maximum Lik-elihood)构建系统发育树，确定细菌菌株的 种属。

1.2.5 病原细菌室内毒力测定 选择5种杀菌剂对从玉米种子胚芽组织分离纯化的菌株进行室内毒力测定。采用抑菌圈法[14]，参照“1.2.2”的方法配置浓度为1×108CFU/mL的菌液悬浮液，待NA培养基冷却至40 ℃与菌悬液混合均匀(体积比为10∶1)后制成含菌平板。在每个含菌NA平板上分别放置3片单层无菌滤纸片(d=5 mm)，以等边三角形的方式排列。根据供试药剂的推荐剂量每种药剂配置成5个不同浓度，其中10%中生·寡糖素可湿性粉剂浓度分别为250、500、1 000、2 000和3 000 μg/mL，3%噻霉酮可湿性粉剂浓度分别为1 000、2 000、3 000、4 000和5 000 μg/mL，2%春雷霉素水剂浓度分别为 2 000、4 000、6 000、8 000和10 000 μg/mL，47%春雷·王铜可湿性粉剂和0.3%四霉素水剂浓度分别500、1 000、2 000、3 000和4 000 μg/mL。在含菌NA平板滤纸片上分别滴加10 μL不同浓度药液，以滴加等量无菌水为空白对照，之后将培养皿置于光照培养箱中在28 ℃培养48 h，采用十字交叉法测量各药剂浓度处理的抑菌圈直径，计算抑菌率。抑菌率=(处理抑菌圈直径-对照抑菌圈直径)/(处理抑菌圈直径-纸碟直径)×100%。

采用SPSS19.0统计分析软件进行毒力回归方程数据分析，药剂浓度换算成对数值作为自变量x，抑菌率的几率值作为因变量y，建立毒力回归方程，通过毒力回归方程计算各药剂抑制中浓度(EC50)值。

2 结果与分析

2.1 病害田间症状

2020 年6月在调查玉米制种田病害时发现玉米植株生长点坏死，无心叶病株(图1)，同时发现部分玉米病株整株矮化，叶片卷曲，沿叶脉两侧出现不规则油渍状褪绿条斑，发病部位叶片组织发白变薄；剥开叶鞘后，在心叶生长点部位零星出现黄褐色病斑，发病较重时生长点坏死，部分茎髓组织缺失，形成不规则缺刻，心叶缺失或呈筒状，植株生长点部位弯曲，部分病株出现分蘖。

A.植株矮化；B、C.心叶缺失、坏死；D.异常分蘖A.Plant dwarfing；B,C.Absence and necrosis of plant heart leaves；D.Abnormal tillering图1 病害田间症状Fig.1 Symptoms of maize bacterial disease in field

2.2 病原细菌形态特征

采用平板划线分离法对玉米种子胚芽组织、幼苗心叶生长点组织进行分离和纯化得到培养性状一致的2株菌株，分别命名为YM-001和YM-002。在NA培养基上生长48 h后，2株菌株菌落颜色呈淡黄色，圆形，稍凸起，表面光滑，边缘整齐，在培养基上不产生其他色素，菌落呈半透明，质地较软微粘。在100倍油镜下观察发现YM-001和YM-002菌体形态呈短杆状，单生或对生，大小分别为0.28～0.85 μm×1.11～1.81 μm和 0.21～0.78 μm×1.13～1.83 μm；在紫外灯下观察KB培养基上生长的菌株，YM-001和YM-002均产生黄绿色荧光(图2)。

A、B.菌株YM-001、YM-002菌落形态；C、D.菌株YM-001、YM-002革兰氏染色形态；E、F.菌株YM-001、YM-002荧光观察A,B.Colony morphology of strains YM-001 and YM-002；C,D.Gram staining morphology of strains YM-001 and YM-002；E,F.Fluorescence observation of strains YM-001 and YM-002图2 病原细菌菌落形态特征Fig.2 Colony morphology of pathogenic bacteria

2.3 分离菌株的致病性测定

带菌种子播种后，苗期发病症状主要表现为植株矮化、叶片皱缩且边缘出现缺刻，叶片表面出现褪绿透明白色斑点，斑点背面呈水渍状，心叶卷曲(图3-A)；成株期叶鞘部位沿叶脉两侧出现不规则油渍状褪绿黄褐色条斑，剥开叶鞘后，在心叶生长点部位零星出现黄褐色病斑，心叶坏死卷曲，植株沿生长点缺失部位弯曲(图3-B)。菌株YM-001和YM-002的菌悬液喷雾接种后第3天，接种植株的部分叶片零星出现不规则油渍状褪绿病斑，接种后第7天，油渍状褪绿病斑沿叶脉扩展产生白色条状病斑，发病部位叶片组织变薄卷曲枯死，边缘出现缺刻，部分植株生长点组织坏死，心叶皱缩缺失，异常矮化(图3-C、3-D和3-E)。接种植株发病症状与田间症状基本一致，对照植株生长正常未见明显异常。对发病植株的心叶生长点组织进行再次分离，重新进行形态学和分子生物学鉴定，结果表明分离菌株与接种菌株病原一致。

A.苗期症状；B.成株期症状；C.接种菌株YM-001；D.接种菌株YM-002；E.接种菌株YM-001和YM-002发病症状；F.清水对照A.Seedling symptoms；B.Adult symptoms；C.Inoculation strain YM-001；D.Inoculation strain YM-002；E.Symptoms of inoculated strains YM-001 and YM-002；F.Control图3 病原细菌致病性测定Fig.3 Pathogenicity determination of pathogenic bacteria

2.4 病原细菌生理生化特征

病原细菌生理生化特征测定结果表明，供试菌株YM-001和YM-002均为革兰氏阳性、兼性厌氧型细菌；烟草过敏反应试验、氧化酶试验、过氧化氢酶试验及硝酸盐还原试验结果均呈阳性；马铃薯腐败试验、淀粉水解试验及明胶液化试验结果均呈阴性，不能利用胱氨酸产生H2S；在 41 ℃不能培养生长，在20～40 g/L NaCl溶液中可以生长；能利用半乳糖、海藻糖、D-甘露糖、D-果糖、蔗糖、L-阿拉伯糖及麦芽糖作为碳源产酸，不能利用D-纤维二糖产酸(表1)。

表1 供试菌株生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of tested strains

2.5 病原细菌分子生物学鉴定

采用16S～23S rDNA间隔区序列通用引物L1/L2对供试菌株YM-001和YM-002的基因组DNA进行PCR扩增，测序获得核苷酸序列(约900 bp)，将其与GenBank中提交的核苷酸序列进行同源性比对，结果显示病原细菌与水稻、棉花、香蕉等寄主植物上分离的分散泛菌(Pantoeadispersa)的同源性达到100%。采用 MEGA5.0软件的Maximum Likelihood法对泛菌属3个不同种(P.agglomerans、P.ananatis、P.dispersa)、黄单胞菌属(Xanthomonasoryzae)、芽孢杆菌属(Bacillussubtilis)与供试菌株YM-001、YM-002构建系统发育树，结果表明YM-001和YM-002与登录号为MK156738、MT367860、MK905711、MG450362的P.dispersa聚在一个分支上，置信度达到100(图4)，同时结合菌落形态特性和生理生化特征，将菌株YM-001和YM-002鉴定为Pantoeadispersa。

图4 基于16S～23S rDNA间隔区序列构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S-23S rDNA sequence

2.6 病原细菌室内毒力测定

采用抑菌圈法进行室内毒力测定，结果显示(表2)5种杀菌剂对菌株YM-001均有一定的抑菌效果，其中0.3%四霉素水剂和47%春雷·王铜可湿性粉剂的抑菌率分别为75.52%和 70.53%。0.3%四霉素水剂EC50值最小为 670.84 μg/mL，47%春雷·王铜可湿性粉剂次之，为920.99 μg/mL。

表2 不同药剂对玉米细菌菌株的毒力Table 2 Toxicity test of different bactericides on maize bacterial strains

3 讨论与结论

本试验通过病原细菌菌落形态特征、生理生化特征及16S-23S rDNA间隔区序列基因组测定和比对分析，将供试玉米种子细菌性病原初步鉴定为分散泛菌(P.dispersa)，虽然与前人报道的玉米细菌性褐腐病病原一致，但病害的危害时期、田间表现症状都存在很大差异。该病害主要在玉米拔节前期危害心叶生长点组织，造成植株皱缩矮化、心叶缺失、异常分蘖，顾沁等[15]报道的玉米细菌性褐腐病主要在灌浆期发生，使植株茎秆表面出现黄褐色干腐、叶梢枯死。相关研究表明，泛菌属细菌是一种腐生菌或植物病斑上的次生菌，在水中、土壤中和动植物伤口中都能分离到[16]，目前关于泛菌属细菌在玉米上引起的病害也有报道。王玲等[17]研究表明玉米细菌性枯萎病的病原为斯氏泛菌(P.stewartii)，由于其侵染危害性较强，已被我国列为检疫性病害对象，曹慧英[9]研究发现成团泛菌(P.agglomerans)可引起玉米细菌性干茎腐病。国外学者研究发现引起玉米叶疫病和细菌性枯萎病的病原为成团泛菌(P.agglomerans)[18]，引起玉米细菌性褐腐病的病原为菠萝泛菌(P.ananatis)[19]，其中斯氏泛菌(P.stewartii)和菠萝泛菌(P.ananatis)复合侵染高粱也会引起叶斑病[20]。近年来，在国内外由泛菌属细菌引起的植物病害发生面积和危害程度逐渐扩大，越来越受到人们的关注，目前由分散泛菌(P.dispersa)引起的水稻叶枯病、棉花铃腐病、香蕉腐烂病已有报道，但在玉米上引起的病害则鲜有报道。本试验对玉米种子(品种为‘N70’)种植后进行带菌检测，发现幼苗发病率达15.28%，同时对种子胚芽组织和幼苗心叶生长点组织进行病原分离与纯化，获得菌落形态特性一致的2株菌株进行致病性测定，结果显示植株在温室中的发病症状与田间症状基本一致，经鉴定分离的病原菌与接种的病原菌相同。初步明确病原从种子内部开始侵染，种子带菌可能是该病害初侵染的主要来源。由于制种玉米田连作年限较长导致土壤菌群结构发生变化，致病菌增多，土壤中是否存在分散泛菌(P.dispersa)侵染玉米种子而引起病害症状还有待进一步研究。同时，本试验仅对玉米种子细菌性病原进行了鉴定，而由该菌引起的整个病害侵染过程还需要设计系统试验进一步验证。

目前，生产上用于细菌病害防治的药剂较少，主要选用抗生素类药剂或铜制剂对病害进行防治。本试验选用5种杀菌剂对病原细菌进行室内毒力测定，试验结果表明抗生素类药剂的抑菌效果优于非抗生素类药剂且用量较少，其中0.3%四霉素水剂抑菌率最高为75.52%，抑制中浓度EC50最低为670.84 μg/mL，其次为47%春雷·王铜可湿性粉剂，这与前人在番茄细菌性叶斑病[21]、糜子细菌性条斑病[22]上报道的研究结果相一致。考虑到该病害可能是由种子带菌引起的，在生产上可以采取种子包衣的措施对病害进行有效防治。0.3%四霉素水剂和47%春雷·王铜可湿性粉剂杀菌谱广、持效期较长、具有内吸传导特性，对作物安全、促进作物生长，同时对该病原具有较好的抑菌效果，可以作为该病的田间防治药剂，但田间防效还有待进一步试验验证。