山西省红芸豆菌核病病原菌鉴定

薛丽芳，翟雅鑫，池吉平，曹 挥，王建明，郝晓娟

(1.山西农业大学 植物保护学院，山西太谷 030801；2.山西省阳泉市郊区农业农村服务中心，山西阳泉 045000；3.山西省忻州市农业产业发展中心，山西忻州 034099)

红芸豆(Phaseolusvulgaris)是一种矮生直立型豆科植物，因其籽粒硕大、色泽鲜艳、具有较高的营养和药用价值，而深受国内外消费者的喜爱[1]。自20世纪90年代以来，根据国际市场上对红芸豆的需求，山西省红芸豆种植面积逐年增加。2020年红芸豆种植总面积达2.63万hm2，年产量约4万t，种植面积居全国第4位[2]。

菌核病是一种世界范围内分布的真菌性病害，可危害十字花科[3-4]、茄科[5-6]、菊科[7]及多种豆科植物[8-11]，由菌核病造成的损失一般在10%以上，严重时可达30%～50%，甚至绝收[12]。菌核病主要由核盘菌属Sclerotinia真菌侵染引起[13]。引起豆科植物菌核病的病原菌种类多样，其中大豆菌核病、扁豆菌核病病原菌为核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)[8-9]；希腊蚕豆菌核病病原菌为三叶草核盘菌(Sclerotiniatrifoliorum)[10]；澳大利亚鹰嘴豆菌核病病原菌为小核盘菌(Sclerotiniaminor)[11]。

近年来，随着红芸豆连年种植以及种植面积的不断扩大，红芸豆菌核病发生日趋严重。本研究对红芸豆菌核病病株进行病原菌的分离与鉴定，旨在明确山西省红芸豆菌核病病原菌的种类，为进一步研究红芸豆菌核病的发生规律和综合防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

于2019年8月在山西省忻州市、吕梁市红芸豆种植区进行菌核病的发病情况调查。同时采集具有典型症状的病株，带回实验室4 ℃保存，备用。

1.2 病原菌分离纯化

采用组织分离法[14]进行病原菌分离：用灭菌刀片于病健交界处切取5 mm×5 mm的组织， 在体积分数为75%乙醇中浸泡30 s，无菌水冲洗干净后，用无菌滤纸吸收组织表面多余的水分，接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上， 25 ℃恒温黑暗培养3 d后，切取单根菌丝顶端至PDA平板上获得纯培养物[14]，将纯化后的菌株转接于PDA斜面试管，于4 ℃保存，备用。

1.3 致病性测定

采用茎部接种法和豆荚离体接种法[8]进行致病性测定。

茎部接种法：种植红芸豆，待第1对真叶展开时，用直径为4 mm的灭菌打孔器在PDA培养的菌落边缘打取菌饼，用无菌牙签挑取接种到幼苗茎部，以无菌PDA饼为对照。每处理5株，设3次重复，室温培养，观察并记录植株的发病情况。

豆荚离体接种法：选取生长一致的红芸豆豆荚，用体积分数为75%乙醇进行表面消毒，无菌水冲洗干净后，用滤纸吸干表面水分。选取另一张浸湿(全部浸湿但无多余水分溢出)的无菌滤纸放入直径为15 cm的培养皿中，将两片无菌载玻片平铺于培养皿中央，把红芸豆豆荚放于载玻片上。无菌牙签刺伤豆荚表面后在伤口上接种直径为4 mm的菌饼，以接种无菌PDA饼的豆荚为对照，每处理5个豆荚，设3次重复，25 ℃黑暗条件下进行保湿培养，观察并记录豆荚的发病情况。

1.4 病原菌鉴定

1.4.1 形态学鉴定 将纯化后的菌株接种到PDA平板上，置于25 ℃下黑暗培养，观察菌落形态和菌核产生情况。将高压蒸汽灭菌30 min的石英砂置于50 mL无菌烧杯中，约1 cm厚，用无菌镊子将菌核从PDA平板上取出，无菌水冲洗后，均匀地放置在石英砂上，用2 cm厚的石英砂覆盖住菌核，烧杯中加入适量无菌水，在17 ℃黑暗条件下保湿培养，观察并记录菌核萌发情况[15]。待菌核萌发后观察子囊盘、子囊、子囊孢子形态特征，根据《植物病原真菌学》、《真菌鉴定手册》初步确定病菌的分类地位[16-17]。

1.4.2 分子生物学鉴定 采用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取病原菌基因组DNA，以ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)为引物扩增菌株ITS基因序列。PCR扩增体系总体积为25 μL，包括DNA模板1 μL，引物各1 μL(10 μmol/L)，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，以ddH2O补足至25 μL。PCR反应程序分别为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，最后 72 ℃延伸10 min。扩增产物经凝胶电泳检测后送至上海生工生物工程有限公司测序，并对测序结果进行BLAST序列比对和同源性分析，利用 MEGA 7.0构建系统发育树，重复1 000 次。

2 结果与分析

2.1 红芸豆菌核病发病症状

红芸豆菌核病多发生在地势低洼田块，一般地块发病率为5%～25%，严重的可达50%以上。该病多从主茎中下部和主茎分叉处开始发病，病斑为褐色水渍状，病斑扩展后植株易从病部折倒(图1-A)。湿度大时发病部位常产生白色棉絮状菌丝，后期可见病部着生黑色鼠粪状菌核(图1-B)。豆荚亦可受害，病斑呈褐色水渍状、不规则形(图1-C)，湿度大时种荚表面及内部可见白色棉絮状菌丝，后期发病部位产生黑色菌核(图 1-D)。

A、B.红芸豆茎及分叉处发病症状；C、D.豆荚发病症状A,B.Symptoms of stems and branches; C,D.Symptoms of seed pod图1 红芸豆菌核病田间症状Fig.1 Symptoms of Sclerotinia rot of red kidney beans in field

2.2 病原菌分离纯化及

通过组织分离法共分离纯化出8个菌株，各菌株形态学特征一致，挑选代表菌株J8-1.8进行致病性测定，结果如下。

茎部接种法：接种J8-1.8菌株7 d后茎部出现病斑，呈水渍状，病斑逐步扩大，表面出现白色霉层，发病后期，病株从接种处折断(图2-A)，对照未见发病(图2-B)。

A.茎部接种J8-1.8 7 d后症状；B.对照；C、D.豆荚接种J8-1.8 7 d、10 d后症状；E.对照A.Stem symptoms after 7 days of inoculation with J8-1.8; B.CK; C,D.Seed pod symptoms after 7 days and 10 days of inoculation with J8-1.8,respectively; E.CK图2 致病性测定结果Fig.2 Pathogenicity test results

豆荚离体接种法：红芸豆豆荚在接种J8-1.8菌株7 d后开始出现水渍状病斑(图2-C)，10 d后病斑扩大，豆荚表面产生白色棉絮状霉层(图2-D)，对照未见发病(图2-E)。

2.3 病原菌鉴定结果

2.3.1 病原菌形态学鉴定 菌株J8-1.8在PDA培养基上菌落呈圆形，气生菌丝发达，绒毛状，初期白色，后变为灰白色，菌丝生长速率为2.14 cm·d-1。培养7 d后在菌落边缘形成鼠粪状的黑色菌核，菌核表面粗糙，质地坚硬，直径2.0～4.5 mm(图3-A)。菌核经黑暗保湿培养58 d后开始萌发，通常产生 1～3个表面光滑的子囊盘，子囊盘和菌核间由柄相连，柄褐色细长，柄基部为黑色，长为5.2～16.4 mm；子囊盘初期呈小杯状，后期盘状，直径1.0～5.3 mm，中央稍凹陷，呈肉色至浅褐色(图3-B、3-C)。将子囊盘切片后观察，子囊圆柱形或梭形，大小为(120.0～140.5)μm×(9.2～11.6)μm，子囊内含8个无色子囊孢子，单行排列，呈椭圆形，大小为(8.4～12.0) μm×(4.0～5.5)μm(图3-D、3-E、3-F)。

A.菌落形态(9 d，正反面)；B、C.子囊盘；D.子囊盘纵切面；E.子囊；F.子囊孢子A.Colony morphology on PDA (9 d,back and front sides); B,C.Apothecium; D.Transverse longitudinal section of apothecium; E.Ascus; F.Ascospores图3 红芸豆菌核病病原菌形态特征Fig.3 Morphological characteristics of pathogen causing Sclerotinia rot of red kidney beans

2.3.2 病原菌分子生物学鉴定 采用通用引物ITS1/ITS4对菌株J8-1.8的rDNA-ITS基因进行PCR扩增后，得到512 bp的基因序列(登录号MZ452605)，将该序列与GenBank数据库中已知序列进行同源性比较分析，结果表明该菌株与核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum，登录号KM272352)同源性为99.61%。采用比邻法构建系统发育树，J8-1.8与核盘菌Sclerotiniasclerotiorum聚为一支(图4)。结合形态学特征和分子生物学鉴定结果，确定红芸豆菌核病病原菌为核盘菌S.sclerotiorum。

图4 基于rDNA-ITS序列构建的菌株J8-1.8及其相关菌株的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of J8-1.8 strain and related strains based on rDNA-ITS sequences

3 讨论与结论

核盘菌属下的种大多是植物病原菌，主要致病种有核盘菌S.sclerotiorum[8-9]、三叶草核盘菌S.trifoliorum[10]、小核盘菌S.minor[11]等。在传统研究中，核盘菌属的分类鉴定主要依据菌核和子囊孢子的形态特征[18]。核盘菌和小核盘菌可通过菌核大小区分，核盘菌产生的菌核明显大于小核盘菌[19-20]。核盘菌与三叶草核盘菌可通过子囊孢子形态特征区分，三叶草核盘菌子囊孢子存在双态性，一个子囊中有两种大小不同的子囊孢子，而核盘菌子囊孢子不存在双态性[21]。随着分子生物学技术的发展，rDNA-ITS基因序列因其在遗传进化中具有高度保守性而被广泛应用于真菌鉴定[22]。本试验通过对分离得到的红芸豆菌核病病原菌进行形态特征观察、致病性测定以及ITS序列分析，确定引起红芸豆菌核病的病原菌为核盘菌S.sclerotiorum。

在核盘菌生活史中，菌核作为病原菌度过不良环境的休眠结构，在病害循环中起到重要的作用。核盘菌菌核萌发有两种方式，一种是子囊盘型萌发，即菌核萌发形成子囊盘，释放子囊孢子侵染植物[23]；另一种是菌丝型萌发，即菌核在适宜条件下萌发形成菌丝，通过伤口、气孔等部位侵入寄主[24]。由核盘菌S.sclerotiorum引起的油菜菌核病、向日葵菌核病可通过两种菌核萌发方式侵染植株，幼苗期主要通过菌核萌发产生菌丝体侵入植株根部、茎基部，花期菌核萌发形成子囊盘，子囊孢子随气流、雨水传播并侵染油菜花瓣和向日葵花盘[4,25-26]。大豆菌核病主要以子囊孢子为初侵染源，田间湿度较大时，大豆茎基部发病处可产生白色菌丝体，成为再侵染源[8]。与核盘菌同属的三叶核盘菌S.trifoliorum所引起的紫花苜蓿菌核病初侵染源为子囊孢子[27]。此外，由人参核盘菌S.ginseng引起的人参菌核病在自然环境及人工环境很难产生子囊盘，主要是由菌核产生的菌丝体为初侵染源[24]。小核盘菌S.minor主要是通过菌核进行菌丝型萌发侵染寄主[28]。目前，尚未有研究报道过山西省红芸豆菌核病菌核的萌发类型及侵染特征，有待于进一步研究。