结直肠癌患者SorCS1基因启动子甲基化检测的临床价值

刘 凯，张沛茹，谢素红，郭 林，卢仁泉

（复旦大学附属肿瘤医院检验科 复旦大学上海医学院肿瘤系，上海 200032）

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，全球范围内的发病率居所有恶性肿瘤的第3位，病死率居第2位[1]。近年来，我国结直肠癌的发病率和病死率均呈上升趋势[2]。有研究结果显示，一些基因的DNA甲基化与结直肠癌的发展密切相关[3]。DNA甲基化对于基因的表达有重要的调节作用[4]，如某些抑癌基因的启动子区域发生甲基化会降低转录活性，使抑癌基因表达沉默，导致细胞增殖异常而发生恶性肿瘤。SEPT9基因是 GTP结合蛋白家族成员，参与了细胞骨架的形成、细胞分裂和肿瘤的发生等，其基因启动子的高甲基化与结直肠癌密切相关。本研究拟通过定量检测结直肠癌患者癌组织与癌旁组织基因启动子甲基化水平，并与肿瘤基因图谱计划（the Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库进行比对，筛选出结直肠癌患者差异表达和启动子甲基化水平升高的基因，并探讨其与结直肠癌发生、发展的关系。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2020年9—11月复旦大学附属肿瘤医院大肠外科就诊的17例结直肠癌患者，其中男9例、女8例，年龄30～74岁。参考美国癌症联合会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第8版肿瘤分期标准[5]进行结直肠癌TNM分期。本研究经复旦大学附属肿瘤医院医学伦理学委员会批准，所有患者均知情同意。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准 经术后或活检后病理确诊为结直肠癌；年龄＞18岁。

1.2.2 排除标准 （1）处于妊娠期或哺乳期的女性；（2）既往有恶性肿瘤病史；（3）既往有腹部外科手术史；（4）术前已行放射治疗或化疗等辅助治疗；（5）病理学类型为恶性黑素瘤、间质瘤、淋巴瘤、神经内分泌癌、鳞癌等非腺癌系恶性肿瘤；（6）原发灶不在结直肠的恶性肿瘤患者（卵巢、宫颈、子宫、空肠、回肠、十二指肠或原发不明恶性肿瘤侵犯结直肠等）。

1.3 方法

1.3.1 一般资料 收集所有患者的临床资料。年龄≤60岁7例，＞60岁10例；肿瘤分期Ⅰ～Ⅱ期4例，Ⅲ～Ⅳ期13例；淋巴结无转移8例，有转移9例；肿瘤部位为直肠10例，结肠7例；肿瘤直径（缺失1例）≤5 cm 12例，＞5 cm 4例。

1.3.2 样本收集 收集术中切除的癌组织样本及距肿瘤＞5 cm的癌旁组织样本，-80 ℃液氮罐保存。

1.3.3 DNA抽提 采用基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司，目录号：DP304]提取组织DNA，严格按试剂盒说明书操作。

1.3.4 基因启动子甲基化检测 采用基于碱基特异性裂解和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）的MassARRAY平台（美国Sequenom公司）上的EpiTYPER方法定量检测基因启动子甲基化，严格按仪器和试剂（内附阴、阳性质控）说明书进行操作。引物由平台内部程序设计并合成。结果判读：基因启动子甲基化结果由仪器直接输出。癌组织与癌旁组织基因启动子甲基化存在差异的筛选条件：（1）阳性质控＞0.7，阴性质控＜0.5；（2）依据厂商提供的资料，癌组织基因启动子甲基化水平均值与癌旁组织的差值应≥0.20。用癌组织基因启动子甲基化检测值-癌旁组织基因启动子甲基化检测值的差值（Δ）表示结直肠癌患者癌组织基因启动子甲基化水平相对于癌旁组织的差异。根据MassARRAY平台的检测值，以癌组织与癌旁组织的差值≥0.20为阳性。

1.3.5 与TCGA数据库的比对分析 将筛选出的基因与TCGA数据库进行比对，查询相关基因的表达及启动子甲基化情况。

1.3.6 SEPT9基因启动子甲基化检测 采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测SEPT9基因启动子甲基化，试剂盒（荧光探针法）购自博尔诚（北京）科技有限公司，检测仪器为ABI 7500荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。严格按仪器和试剂盒（内附ACTB作为内参引物）说明书操作。结果判读：SEPT9启动子甲基化水平结果由循环阈值（cycle threshold，Ct）计算而来，计算公式[6]为：ΔΔCt组织=ΔCt组织-ΔCt内参；ΔCt组织=Ct组织ACTB-Ct组织SEPT9；ΔCt参照品=Ct参照品ACTBCt参照品SEPT9；式中参照品为阳性对照品，ΔΔCt组织为组织基因启动子甲基化水平，2ΔΔCt癌组织-ΔΔCt癌旁组织为癌组织相对于癌旁组织基因启动子甲基化水平的差异，参考值取5，以2ΔΔCt癌组织-ΔΔCt癌旁组织＞5为SEPT9基因启动子甲基化阳性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。非正态分布的数据以中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，2个配对组之间比较采用Wilcoxon W符号秩和检验，2个独立组之间比较采用 Mann-Whitney U秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌患者癌组织与癌旁组织SorCS1基因和CASR基因启动子甲基化水平比较

采用MassARRAY平台检测结直肠癌患者癌组织与癌旁组织KHDRBS2、CNTN1、IRF4、ARHGAP20、NDRG4、GFRA1、CPEB1、NPY、CRHR2、SorCS1、PTPRT、CASR基因启动子甲基化水平。癌组织SorCS1基因和CASR基因启动子甲基化水平均显著高于癌旁组织（P＜0.001），其他基因不符合筛选条件予以剔除。见图1。

图1 结直肠癌患者癌组织与癌旁组织SorCS1基因和CASR基因启动子甲基化水平比较

2.2 与TCGA数据库的比对结果

与TCGA数据库的比对结果显示，膀胱尿路上皮癌、宫颈鳞状细胞癌、结肠腺癌、多形性胶质母细胞瘤、直肠腺癌、胃腺癌患者的SorCS1基因相对表达量均低于正常对照者（P＜0.05），结肠癌、直肠癌、肺腺癌患者SorCS1基因启动子甲基化水平均明显高于正常对照者（P＜0.05），见图2。结直肠癌患者和正常对照者CASR基因相对表达量均较低（TPM＜1），且两者之间差异无统计学意义（P＞0.05），TCGA数据库中无CASR基因启动子甲基化的数据。

图2 SorCS1基因启动子甲基化水平分析比较

2.3 癌组织与癌旁组织SEPT9基因启动子甲基化水平比较

结直肠癌组织SEPT9基因启动子甲基化水平均显著高于癌旁组织（P＜0.001）。见表1。

表1 结直肠癌组织与癌旁组织SEPT9基因启动子甲基化水平的比较

2.4 不同临床病理特征结直肠癌患者癌组织与癌旁组织SorCS1、CASR、SEPT9基因启动子甲基化水平差异比较

Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的结直肠癌患者ΔSorCS1基因和SEPT9基因启动子甲基化水平分别高于Ⅰ～Ⅱ期患者和无淋巴结转移的患者（P＜0.05），而不同性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径的患者之间ΔSorCS1基因和SEPT9基因启动子甲基化水平差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同临床病理特征结直肠癌患者之间ΔCASR基因差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 不同临床病理特征结直肠癌患者之间SorCS1基因、CASR基因、SEPT9基因启动子甲基化水平比较

续表2

2.5 结直肠癌患者癌组织SorCS1基因与SEPT9基因启动子甲基化阳性率比较

SorCS1基因启动子甲基化阳性率为82.35%（14/17），SEPT9基因启动子甲基化阳性率为70.58%（12/17），两者联合检测阳性率为88.24%（15/17）。

3 讨论

结直肠癌是由多基因突变和表观遗传改变等致病机制逐渐积累和相互作用引起的。基因甲基化是目前研究最为深入的表观遗传学现象，若局部出现高甲基化，会导致基因组极不稳定，最终诱发肿瘤。有研究结果显示，异常甲基化导致的基因表达下调与结肠组织从良性到恶性病变的病理发展过程密切相关[7]。目前，SEPT9基因启动子甲基化检测在结直肠癌的筛查与临床诊疗中已被广泛应用[8-9]，而SorCS1基因启动子甲基化与肿瘤的关系还鲜有报道。SorCS1是神经元受体运输的关键调节因子，可结合多种特异性配体完成营养物质的转运、信号转导调控、中枢系统代谢控制等生理过程[10-11]。SorCS1的表达水平与阿尔茨海默病[12]、2型糖尿病[13]及慢性肾脏疾病[14]等有关。

本研究通过MassARRAY平台检测结直肠癌患者癌组织与癌旁组织KHDRBS2、CNTN1、IRF4、ARHGAP20、NDRG4、GFRA1、CPEB1、NPY、CRHR2、SorCS1、PTPRT、CASR基因启动子甲基化水平，筛选后发现癌组织SorCS1基因和CASR基因启动子甲基化水平均显著高于癌旁组织（P＜0.001）。与TCGA数据库比对后发现，膀胱尿路上皮癌、宫颈鳞状细胞癌、结肠腺癌、多形性胶质母细胞瘤、直肠腺癌、胃腺癌患者的SorCS1基因相对表达量低于正常对照者（P＜0.05），而在结肠癌、直肠癌、肺腺癌中SorCS1基因启动子甲基化水平明显高于正常对照者（P＜0.05）。提示SorCS1基因启动子甲基化水平的升高可能影响了SorCS1基因的表达，这与HUANG等[15]SorCS1 mRNA和蛋白表达的缺失与相应启动子甲基化高度相关（P＜0.001、P=0.033）的研究结果一致。

SorCS1是VPS10结构域受体家族5个成员之一，另外4个成员分别为Sortilin、SorCS2、SorCS3和SorLA。既往研究发现，VPS10P的受体Sortilin增强了乳腺癌细胞的侵袭作用[16]，还可促进卵巢癌细胞的增殖[17]。有研究结果显示，SorCS2在生存率较低的结直肠癌患者中表达上调[18]，而胃癌患者中SorCS3呈高甲基化[19]。虽然目前尚未完全了解VPS10结构域受体家族的5个成员在肿瘤中的作用机制，但结合相关研究结果，推测该家族在肿瘤的发展中可能具有重要作用。本研究结果显示，Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的结直肠癌患者SorCS1基因和SEPT9基因启动子甲基化水平分别高于Ⅰ～Ⅱ期和无淋巴结转移的患者（P＜0.05），不同性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径的患者之间癌组织与癌旁组织SorCS1基因和SEPT9基因启动子甲基化水平的差异均无统计学意义（P＞0.05）；而不同临床病理特征的结直肠癌患者之间CASR基因启动子甲基化水平差异均无统计学意义（P＞0.05），提示SorCS1基因可能与结直肠癌的进展有关。虽然SorCS1在肿瘤中的功能还不明确，但一些SorCS1相关基因，如STAT3、PDGF-BB、AMPARs和突触蛋白神经素已被证明与肿瘤发展有关[20-21]。在对SorCS1基因下游机制的研究中，LARSEN等[22]发现，SorCS1基因表达的降低减少了HEK-293细胞中磷酸化信号转导及转录激活因子3的生成。虽然SorCS1可以抑制某些细胞中的促癌因子，但还需要更深入的研究来阐明SorCS1在结直肠癌中的功能和潜在机制。

本研究结果还显示，SorCS1基因启动子甲基化阳性率高于SEPT9基因启动子甲基化阳性率，与李丹等[23]的Meta分析结果基本相符，且SorCS1基因联合SEPT9基因启动子甲基化检测可提高对结直肠癌的检测阳性率。基因启动子甲基化作为辅助分子分期参数可用于区分国际抗癌联盟（the Union for International Cancer Control，UICC）分期和 TNM分期，与目前所用的TNM分期系统结合，可有效提高现有治疗方案的效率[24]。

本研究的不足之处在于样本量较小，尚需要多中心大样本量研究来进一步验证SorCS1基因启动子甲基化在结直肠癌中的作用，并更深入地研究SorCS1影响结直肠癌发生、发展的具体机制。

综上所述，SorCS1基因启动子甲基化检测在结直肠癌患者中有较高的阳性率，且可与SEPT9基因启动子甲基化检测形成互补，或可作为结直肠癌筛查潜在的分子标志物。

致谢：感谢上海吉凯医学检验所有限公司迟连凯博士对本研究的支持与帮助。