冬凌草甲素通过上调miR-204-5p 抑制PC-3 细胞迁移与侵袭的作用机制研究

施浩然，包广龙，令狐熙涛，吴洪瀚，赵泽驹，刘霄，付瑶，黄帅，瓦庆德

1.遵义医科大学第二附属医院骨科，贵州 遵义 563000；2.遵义医科大学附属医院泌尿外科，贵州 遵义 563003；3.遵义医科大学第二附属医院肿瘤科，贵州 遵义 563003；4.四川大学华西第二医院康复医学科，成都 610041；5.广州医科大学第二附属医院骨科，广州 510260

前列腺癌（prostate cancer，PCa）骨转移是PCa 患者的主要死因，目前PCa 骨转移的治疗措施包括手术、化疗及放疗等，其中化疗是PCa 骨转移的主要治疗方法之一。但化疗易导致胃肠道反应、神经病变等副作用，因此探索有效且毒副作用较小的PCa 骨转移治疗药物具有重要临床意义[1～3]。微 小RNA（microRNAs，miRNAs）是一类短链非编码RNAs，通过与目的基因3'-UTR 区结合抑制目的基因的表达，在PCa 骨转移中发挥重要调控作用[4,5]。本研究组前期研究发现，miR-204-5p 通过调控PCa 细胞NF-κB 信号通路下游基因的活性，从而抑制PCa 细胞的迁移、侵袭与骨转移，表明miR-204-5p 是临床干预PCa 骨转移的靶点之一[6]。冬凌草甲素（Oridonin，ORI）是一类分离自冬凌草的二萜类活性物质，其可通过诱导肿瘤细胞凋亡和自噬、阻滞细胞周期及逆转细胞耐药等途径抑制肿瘤生长[7]。但冬凌草甲素能否通过调控miR-204-5p 和NF-κB 信号通路抑制PCa 细胞的转移尚不清楚。2020 年6 月至2021 年3 月，本研究探索了冬凌草甲素通过调控miR-204-5p 和NF-κB 信号通路影响PC-3 细胞的增殖、迁移及侵袭机制，为冬凌草甲素作为潜在抗PCa 骨转移药物提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人前列腺癌细胞PC-3 细胞系购自ATCC（美国典型培养物保藏中心，美国），使用补充有10%胎牛血清、5%青霉素和链霉素的1640 培养基将细胞接种至75 cm2培养瓶，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞进行后续试验。

1.1.2 主要试剂 冬凌草甲素（武汉慧诚益通生物公司），RPMI 1640 培养基、0.25% 胰蛋白酶-EDTA（Hyclone，美国），胎牛血清、青霉素/链霉素(Gibco，美国)，P65、P84、TRAF1、TAB3 和MAP3K3 抗 体（Cell Signaling Technology，美国），CCK-8 细胞活性检测试剂盒（北京全式金生物技术有限公司），RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒和荧光定量PCR 试剂盒（Takara，日本），BCA 蛋白浓度测定试剂盒、超敏ECL 化学发光试剂盒（碧云天生物科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞增殖能力测定 0.25%胰酶消化PC-3 细胞制备细胞悬液，以2×103个/孔密度接种至96 孔培养板中，每组设5 个重复。待细胞贴壁后加入0、0.1、1、5、10、15、20、30、40 μmol/L 的冬凌草甲素溶液，继续培养24 h 后各孔加入10 μL CCK8 试剂孵育2 h，然后用酶标仪检测450 nm 波长处的吸光度值。

1.2.2 qRT-PCR 分析 分别用浓度为0、5、10、15、20、30、40 μmol/L 的冬凌草甲素溶液处理细胞24 h，RNA提取试剂盒提取总RNA，根据Takara 试剂盒将总RNA 逆转录成cDNA，然后使用Qantifest SYBR green mix（Qiagen）扩增。以U6 或GAPDH 作为对照，基因的相对表达率使用2-ΔΔCt法计算。引物详细序列如下：

1.2.3 细胞转染 将细胞以1×103个/孔的密度接种至96 孔平板中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养至40%，使用Lipofectamine 3000 转染试剂将miR-204-5p模拟物转染入PC-3 细胞。

1.2.4 Western blot 分析 将PC-3 细胞接种至100 cm2培养皿中，待细胞密度增殖至80%时加入0、10 μmol/L 的冬凌草甲素溶液，24 h 后利用RIPA 与PMSF 混合裂解液提取药物处理后的细胞总蛋白，BCA 标准法进行蛋白定量。制备10%～12%的SDS-PAGE 凝胶进行电泳，PVDF 膜电转2 h，2% BSA 封闭1 h 后加入一抗，4 ℃冰箱避光孵育。TBST 洗涤3 次后加入二抗孵育1 h，加入ECL 发光液，在成像系统中曝光条带。

1.2.5 迁移和侵袭能力检测 酶消化，离心后重悬细胞沉淀，调整细胞密度至1×106个/mL，将100 μL 重悬液加入Transwell 上室，下室加入800 μL 细胞培养基，然后继续培养24 h。24 h 后取出小室，4%多聚甲醛固定30 min，洗涤后用湿棉签小心去除上室面细胞，然后用0.1%结晶紫进行染色20 min，晾干后在倒置显微镜随中机选取5 个高倍视野进行拍照和计数，计算平均值。检测细胞迁移能力时未在上室添加Matrigel 基质胶，而在检测细胞侵袭能力时，需用Matrigel 基质胶稀释液（1：5）包被Transwell 上室面基底膜，其余实验条件相同。

1.3 统计学方法

所有实验均重复3 次以上，数据以均数±标准差表示。用SPSS 18.0 进行分析，组间差异比较采用t检验，P＜0.05 代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 冬凌草甲素抑制PC-3 细胞增殖

采用CCK8 检测不同浓度冬凌草甲素溶液对细胞增殖能力的影响，结果表明冬凌草甲素呈浓度依赖性抑制PC-3 细胞的增殖，差异较对照组具有统计学意义（P＜0.05），其IC50值约为10 μmol/L（图1A）。在此基础上，用10 μmol/L 冬凌草甲素溶液处理PC-3 细胞0、1、2、3、4、5 d 后，用CCK8 法检测细胞的增殖能力，结果表明冬凌草甲素呈时间依赖性抑制PC-3 细胞的活力，差异较对照组具有统计学意义（P＜0.05）（图1B）。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 Sequence of primers used for qRT-PCR

2.2 冬凌草甲素抑制PC-3 细胞迁移及侵袭

Transwell 迁移及侵袭实验结果显示，用0、5、10、20 μmol/L 冬凌草甲素溶液处理PC-3 细胞24 h 后，冬凌草甲素呈浓度依赖性抑制细胞迁移（图2）及侵袭能力（图3），与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 冬凌草甲素上调miR-204-5p 表达并抑制NF-κB信号通路

用不同浓度（0、5、10、15、20 μmol/L）的冬凌草甲素溶液处理PC-3 细胞24 h 后，qRT-PCR 实验结果表明冬凌草甲素溶液以浓度依赖性上调miR-204-5p 的表达，并抑制NF-κB 信号通路分子TRAF1、TAB3、P65 和MAP3K3 的表达（图4A～E），与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。WB 实验结果表明，过表达miR-204-5p 和冬凌草甲素均可抑制PC-3 细胞表达TRAF1、TAB3、P65 和MAP3K3，二者对NF-κB 信号通路调控作用相同（图4F）。

3 讨论

化疗是晚期PCa 骨转移患者的主要治疗方法之一，但传统化疗药物存在毒副作用及耐药等不足，因此亟需寻找有效且毒副作用较低的药物[8～10]。多种天然药用植物活性成分具有高效抗瘤和低毒性的优势，如雷公藤提取物南蛇藤素能抑制PC-3 细胞增殖、迁移、VEGF 分泌和体内致瘤性[11]；槲皮素通过抑制细胞增殖和迁移、诱导细胞凋亡等抑制PC-3 细胞在体内外的致瘤作用[12]。本研究探索冬凌草甲素对PC-3细胞的作用及机制，为冬凌草甲素作为潜在候选药物治疗PCa 骨转移提供前期实验参考。

3.1 冬凌草甲素抑制PC-3 细胞增殖、迁移及侵袭

冬凌草甲素是冬凌草的有效成分，研究表明其具有良好的抗瘤活性，Xia 等[13]发现冬凌草甲素可通过诱导细胞凋亡和阻断Notch 信号通路抑制乳腺癌细胞生长和转移；Xu 等[14]发现冬凌草甲素可通过阻断FAK-ERK1/2 信号通路抑制肺癌细胞的迁移和上皮-间质转化。

本研究探索了冬凌草甲素在体外是否能抑制PC-3 细胞的增殖、迁移与侵袭。首先用不同浓度的冬凌草甲素溶液（0、0.1、1、5、10、15、20、30、40 μmol/L）处理PC-3 细胞，24 h 后用CCK8 检测其对细胞增殖能力的影响，结果显示与对照组相比，冬凌草甲素溶液呈浓度依赖性抑制PC-3 细胞的增殖，其半抑制率（IC50）为10 μmol/L。在此基础上，用10 μmol/L 的冬凌草甲素溶液处理细胞1～5 d 后，CCK8 检测结果显示，与对照组相比冬凌草甲素溶液呈时间依赖性抑制PC-3 细胞的增殖。其次，用0、5、10、20 μmol/L 冬凌草甲素溶液处理PC-3 细胞24 h，然后通过Transwell检测细胞迁移及侵袭能力的变化，结果表明冬凌草甲素溶液呈浓度梯度抑制PC-3 细胞的迁移及侵袭能力，在5、10、20 μmol/L 冬凌草甲素溶液作用下，迁移及侵袭的细胞数较对照组明显减少。上述结果提示冬凌草甲素在体外能抑制PC-3 细胞的增殖、迁移和侵袭。

3.2 冬凌草甲素通过上调miR-204-5p 抑制NF-κB 信号通路参与调控PC-3 细胞的转移

microRNAs 是一类广泛分布于真核生物中的非编码RNA，其通过结合靶基因的3′UTR 区域以介导基因降解或抑制其翻译[15,16]。研究发现microRNAs 的异常表达与肿瘤发生发展密切相关，可作为肿瘤诊断的标志物和治疗靶点[17,18]。课题组前期研究发现，miR-204-5p 在PCa 患者骨转移组织和血清样本中表达下调，上调miR-204-5p 表达可以抑制PCa 细胞在体内外的迁移、侵袭和骨转移；同时发现miR-204-5p 通过靶向TRAF1、TAB3 和MAP3K3 抑制NF-κB 信号通路活性，从而抑制PCa 细胞的侵袭、迁移和骨转移能力[6]。miR-204-5p 在PCa 骨转移过程中具有重要的调控作用，但冬凌草甲素能否通过调控miR-204-5p 表达影响PCa 细胞的转移能力尚不明确。因此本研究重点是探索冬凌草甲素抑制PC-3 细胞的增殖、迁移与侵袭是否与miR-204-5p 有关。首先用不同浓度（0、5、10、15、20 μmol/L）冬凌草甲素溶液处理PC-3 细胞24 h，然后用PCR 检测miR-204-5p 的mRNA 表达，结果显示，与对照组相比冬凌草甲素能上调PC-3 细胞中miR-204-5p的表达，在10 μmol/L时上调作用最明显。

NF-κB 是肿瘤发生、发展和转移过程的关键调节因子[19,20]。Park 等[21]发现NF-κB 通过刺激集落刺激因子促进乳腺癌骨转移，表明NF-κB 是乳腺癌骨转移的防治靶点之一。我们前期研究已发现NF-κB 信号通路与PCa 细胞的侵袭、迁移和骨转移能力相关，在本研究中，PCR 结果表明不同浓度的冬凌草甲素溶液除能上调miR-204-5p 外，同时抑制NF-κB 信号通路下游基因P65、TRAF1、TAB3 和MAP3K3 的表达。此外，Western blot 结果表明，冬凌草甲素溶液处理组与过表达miR-204-5p 结果一致，PC-3 细胞中NF-κB 信号通路下游分子P65、TRAF1、TAB3 和MAP3K3 蛋白表达较对照组均明显下调。因此推测冬凌草甲素可上调miR-204-5p 阻断NF-κB 信号通路分子表达参与调控PC-3 细胞的转移能力。

综上所述，本研究表明冬凌草甲素在体外能抑制PC-3 细胞的增殖、迁移及侵袭，可能与上调miR-204-5p 表达并阻断NF-κB 信号通路活性有关。本课题主要探索了冬凌草甲素在体外对PC-3 细胞的抗瘤作用，下一步将以动物模型验证其在体内的抗瘤作用，以期为冬凌草甲素作为潜在抗PCa 药物提供前期实验参考。