1,25(OH)2D3对2型糖尿病大鼠心肌损伤的改善作用

黄国玉，刘亚萍，张玉晶，李 星，李文杰

郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 450001

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病重要的并发症之一[1-2]。在高血糖背景下，心肌组织氧化应激及细胞凋亡加剧，导致心肌形态学和结构异常，心功能受损[3-4]。1,25(OH)2D3是维生素D在体内的活性形式，能够与维生素D受体相互作用，参与骨代谢、免疫调节、细胞增殖和分化等多种生理过程[5]。动物实验[6]证实维生素D与心肌能量代谢变化、氧化应激、炎症、细胞凋亡等有关。补充1,25(OH)2D3可减轻DCM大鼠心肌肥大、自噬、纤维化、凋亡等病理变化[7-9]，但1,25(OH)2D3通过调节糖脂代谢对DCM的影响及其相关的调节机制尚未明确。本研究观察了1,25(OH)2D3对2型糖尿病大鼠心肌损伤的改善作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料50只SPF级雄性4周龄SD大鼠购于河南省实验动物中心，许可证号：SCXK(豫)2015-0004。1,25(OH)2D3购于德国Gatalent Germany Eberbach GmbH公司，链脲佐菌素(STZ)购于美国Sigma公司，空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)测定试剂盒购于中生北控生物科技股份有限公司，丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)及肌酸激酶(creatine kinase，CK)测定试剂盒购于南京建成科技有限公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒与SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购于北京鼎国生物技术有限责任公司,HE染色试剂盒购于武汉塞维尔生物技术有限公司，PI3K、p-Akt和Caspase-3抗体均购于武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2 2型糖尿病大鼠模型的构建及实验分组SD大鼠适应性喂养1周后，随机选8只作为正常对照组，每日普通饲料喂养。其余42只大鼠高糖高脂饲料喂养5周后腹腔注射STZ溶液(35 mg/kg)，72 h后尾静脉采血检测FBG≥16.7 mmol/L且1周后FBG未恢复正常为2型糖尿病模型造模成功。将造模成功的大鼠随机分为2型糖尿病组及低、中、高剂量干预组，每组8只。低、中、高剂量干预组每日分别给予0.075、0.150、0.300 μg/kg溶于玉米油的1,25(OH)2D3灌胃，正常对照组和2型糖尿病组每日给予等量玉米油灌胃。干预前尾静脉采血，干预12周后麻醉处死大鼠，收集血液和心脏标本。

1.3 血清FBG、TC、TG、LDH和CK水平的测定取干预前后血液标本，3 000 r/min离心10 min，按照试剂盒及全自动生化分析仪操作说明测定干预前后大鼠血清FBG、TC和TG水平，采用比色法并按照试剂盒要求测定干预后血清LDH和CK水平。

1.4 心肌组织形态学观察大鼠心肌组织经多聚甲醛固定后石蜡包埋、4 μm厚切片，进行HE染色。

1.5 心肌组织MDA水平和SOD活性的测定取心肌组织，称重后放入预冷的生理盐水中，冰上研磨为组织匀浆后4 ℃、5 000 r/min离心10 min，取上清液，采用酶标法参照试剂盒操作说明检测MDA水平和SOD活性。

1.6 心肌组织中PI3K、p-Akt、Caspase-3蛋白表达的测定采用Western blot法。取心肌组织，用组织蛋白提取试剂盒提取总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量，取蛋白与5×上样缓冲液振荡混匀，沸水煮10 min。上样50 μg进行电泳、转膜，PVDF膜在50 g/L脱脂奶粉溶液中孵育2 h，加一抗(GAPDH、PI3K、p-Akt抗体按1∶5 000稀释，Caspase-3抗体按1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，10 min/次，重复3次后加二抗(1∶5 000稀释)孵育2 h，再次洗膜后显影，用Image J软件处理，目的蛋白表达量为目的蛋白条带与GAPDH条带灰度值的比值。

1.7 统计学处理采用SPSS 23.0处理数据。5组大鼠干预前后血清FBG、TC和TG水平的比较采用重复测量数据的方差分析；干预后5组大鼠血清LDH、CK水平及心肌组织氧化应激因子、相关蛋白表达的比较采用单因素方差分析，采用LSD-t法进行组间两两比较。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠干预前后血清FBG、TC和TG水平比较干预前2型糖尿病组及各剂量干预组大鼠血清FBG、TC和TG水平高于正常对照组；干预12周后，与2型糖尿病组比较，低、中、高剂量干预组大鼠血清FBG水平下降，高剂量干预组大鼠血清TC和TG水平下降。见表1。

表1 各组大鼠干预前后血清FBG、TC、TG水平比较(n=8) mmol/L

2.2 各组大鼠干预后血清CK和LDH水平比较干预12周后，2型糖尿病组大鼠血清CK和LDH水平高于正常对照组，而中、高剂量干预组大鼠血清CK和LDH水平低于2型糖尿病组。见表2。

表2 各组大鼠干预后血清CK和LDH水平比较(n=8)

2.3 各组大鼠干预后心肌组织形态比较干预12周后，HE染色结果(图1)显示，正常对照组大鼠心肌细胞形态正常，结构完整，排列致密规则，细胞核分布均匀。2型糖尿病组大鼠心肌细胞肥大，结构模糊，排列紊乱，部分出现纤维断裂。与2型糖尿病组相比，各干预组大鼠心肌细胞形态结构趋于整齐，排列相对规则，细胞肥大和纤维断裂情况相对改善,高剂量干预组改善更为显著。

A：正常对照组；B：2型糖尿病组；C：低剂量干预组；D：中剂量干预组；E：高剂量干预组

2.4 各组大鼠干预后心肌组织MDA水平和SOD活性比较干预12周后，与正常对照组相比，2型糖尿病组大鼠心肌组织中MDA水平升高，SOD活性下降；与2型糖尿病组相比，中、高剂量干预组大鼠心肌组织中MDA水平降低，SOD活性升高。见表3。

表3 各组大鼠干预后心肌组织中MDA水平和SOD活性的比较(n=8)

2.5 各组大鼠干预后心肌组织中PI3K、p-Akt、Caspase-3蛋白表达情况干预12周后，与正常对照组相比，2型糖尿病组大鼠心肌组织中PI3K、p-Akt蛋白表达水平下降，Caspase-3蛋白表达水平升高；与2型糖尿病组相比，中、高剂量干预组大鼠心肌组织中PI3K、p-Akt蛋白表达水平上升，Caspase-3蛋白表达水平降低。见图2、表4。

1：正常对照组；2：2型糖尿病组；3：低剂量干预组；4：中剂量干预组；5：高剂量干预组

表4 各组大鼠干预后心肌组织中PI3K、p-Akt、Caspase-3蛋白表达水平的比较(n=8)

3 讨论

据国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation，IDF)发布的第9版全球糖尿病地图，2019年约有4.63亿人患有糖尿病，占全球成年(20～79岁)人口的9.3%，预计到2045年将增至7亿(10.9%)[10]。糖脂代谢紊乱是糖尿病的一大特征[11]，其可引起心肌细胞中脂肪酸氧化增加，进而导致心肌损伤[12]。PI3K/Akt是调节糖脂代谢的经典信号通路，同时在调节细胞增殖、分化、凋亡等方面发挥重要作用，该通路关键蛋白的表达异常可导致多种疾病的发生[13-14]。对于正常心肌细胞，胰岛素可通过PI3K/Akt通路介导葡萄糖转运，促进葡萄糖摄取，增强葡萄糖氧化，调节心肌细胞代谢；然而，在糖尿病状态下，胰岛素介导的葡萄糖摄取和能量供应异常，导致心肌细胞代谢和功能障碍[15-16]。本研究中，2型糖尿病大鼠经1,25(OH)2D3干预12周后，FBG、TC和TG水平下降，这与Eftekhari 等[17]的研究结果一致；同时Western blot结果显示心肌组织中PI3K、p-Akt蛋白表达增加。由此推测1,25(OH)2D3通过上调2型糖尿病大鼠心肌组织中PI3K/Akt通路，加强葡萄糖的转运，改善心肌细胞能量代谢。此外，研究[18]表明糖脂代谢紊乱介导的氧化应激在DCM的发生发展中发挥着重要作用，高血糖会增加心肌脂肪酸 β 氧化，心肌组织中自由基大量生成，从而引起了心肌细胞的氧化应激。本研究结果显示，1,25(OH)2D3干预后，2型糖尿病大鼠心肌组织中MDA 水平下降，SOD活性上升，这与既往研究[19]结果一致，可能因为1,25(OH)2D3干预改善了糖脂代谢紊乱，减少了脂质过氧化联级反应，从而减轻了氧化应激。

氧化应激的加剧可引起心肌损伤[20]。血清CK和LDH水平可在一定程度上反映心肌受损情况[21]。Zhang等[22]研究发现STZ诱导8周的2型糖尿病小鼠模型血清CK和LDH水平显著升高。Zeng等[8]研究发现1,25(OH)2D3干预可降低2型糖尿病大鼠血清LDH和CK水平。本研究中，1,25(OH)2D3干预后，2型糖尿病大鼠血清CK和LDH水平降低；心肌细胞形态结构趋于整齐，排列相对规则，细胞肥大和纤维断裂情况明显改善，大鼠心肌组织中Caspase-3蛋白表达下降。在心肌缺血再灌注损伤或心肌梗死等研究中同样发现激活PI3K/Akt通路可抑制Caspase-3蛋白的联级反应，从而抑制心肌细胞的过度凋亡，起到保护心肌的作用[23-24]。

综上，1,25(OH)2D3可能通过激活PI3K/Akt信号传导通路，调节糖脂代谢紊乱，降低氧化应激水平，减少心肌细胞凋亡，从而改善2型糖尿病大鼠心肌损伤，这为DCM的防治提供了新思路。