CLPTM1L变异与云南汉族人群非小细胞肺癌的相关性*

张云云， 黄凤丹， 马千里， 张新文， 李盈甫， 何秀莲， 李传印， 姚宇峰， 刘伟鹏**

(1.中国医学科学院 & 北京协和医学院 医学生物学研究所， 云南 昆明 650118； 2.云南大学 研究生院， 云南 昆明 650504； 3.昆明医科大学第三附属医院 胸外科， 云南 昆明 650118； 4.昆明医科大学第一附属医院 干疗科， 云南 昆明 650032)

肺癌是最常见的癌症类型之一，2020年全世界估计有超过220万新报告肺癌病例和超过179万新增肺癌死亡病例[1]。非小细胞肺癌(NSCLC)包含鳞癌、腺癌以及大细胞癌三种病理亚型，占所有肺癌病例的85%以上[2]。虽然吸烟是肺癌发生的主要诱因，但很早人们就已经认识到肺癌具有在家族内部聚集的遗传倾向[3]，针对双生子的研究显示肺癌的遗传率约为18%[4]；对肺癌的遗传结构分析显示，常见单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)能够解释很大一部分肺癌的遗传力。在过去的几十年里，研究人员已经将注意力转移到众多致癌/抗癌基因中常见单核苷酸多态性的研究中[5-7]。近年在全基因组关联研究 (genome-wide association studies, GWAS) 中已经鉴定到上百个与肺癌发生风险显著相关的基因座[5,8]。重复研究及精细定位研究也发现唇腭裂跨膜1样蛋白(cleft lip and palate transmembrane protein 1-like，CLPTM1L)基因区域的多个单核苷酸多态性变异在多种族人群中都与肺癌的发生风险具有显著的相关性，包括rs401681、rs402710和rs31489[9-11]，提示该区域内可能具有多个独立的风险功能变异，然而，由于 GWAS的分辨率受到群体连锁不平衡结构的限制，直到目前CLPTM1L基因区域内真正发挥生物学作用的功能变异仍旧不清楚。有研究表明，位于基因转录调控区域的SNP能够通过调节特定基因的表达来增加其携带者罹患肺癌的风险[12-14]。因此，对CLPTM1L转录调控区内的单核苷酸多态性变异开展进一步分析，并评估这些变异位点与肺癌发生风险之间的相关性，将有助于鉴定CLPTM1L基因座中的潜在功能变异位点，为肺癌的诊断和治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 样本来源

本研究经昆明医科大学第三附属医院伦理委员会批准(审查编号KYCS202198)，每位参与者均签署知情同意书。随机挑选2015—2018年在昆明医科大学第三附属医院被诊断为非小细胞肺癌的500例患者作为病例组，并选取同一时期在该医院参加体检613例健康体检者作为对照组。病例组排除标准：(1)采样之前接受过放疗、化疗等抗肿瘤治疗手段的患者;(2)患有其他恶性肿瘤的患者或者患有心血管疾病、糖尿病等慢性疾病的患者;(3)诊断结果不明确、临床资料不完整者。本次研究所有参与者全部为云南地区的汉族人群。

1.2 研究方法

1.2.1样本基因组DNA提取 使用血液DNA提取试剂盒(QIAGEN，货号51106)提取外周血基因组DNA，使用超微量紫外可见分光光度计(ND-2000，Thermo Fisher Scientific)检测提取的基因组DNA的质量是否合格，并存放于-20 ℃冰箱备用。

1.2.2SNP位点选择 本研究选取CLPTM1L基因上游2 000 bp的区域作为CLPTM1L基因的转录调控区，并借助HaploReg v4.1[Ha]ploReg v4.1 (broadinstitute.org)〗对已报道与肺癌发生风险相关的CLPTM1L基因区域SNP位点(rs401681、rs402710和rs31489)及与其高度连锁的SNP位点进行功能预测，根据每个SNP所在区域的染色质状态，选取位于基因启动子或者增强子区域内的SNP位点作为候选功能SNP位点[15]。由于rs27069、rs27070、rs27071和rs27996位于CLPTM1L基因上游的转录调控区，并位于基因启动子或者增强子区域内，更可能具有调控CLPTM1L的生物学功能。因而在本研究中选取了rs27069、rs27070、rs27071和rs27996这4个SNP位点作为候选位点用于后续研究。

1.2.3SNP位点基因分型 采用TaqMan探针法对CLPTM1L转录调控区SNP位点rs27069、rs27070、rs27071和rs27996进行基因分型，TaqMan探针(货号C___2854672_10、C___2854671_20、C___2854670_10和C___8769810_10)及分型试剂盒(货号A30866)均购自美国 ABI公司。利用ABI公司的QuantStudio 6实时荧光定量PCR仪进行基因分型实验。PCR反应体系的总体积为5 μL：Roche 2×prime STAR Max 2.5 μL，20× Probe 0.25 μL，样品DNA 1 μL，无菌水1.25 μL。反应条件为95 ℃预变性10 min，92 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、扩增40个循环，72 ℃ 延伸5 min。使用QuantStudioTMReal-Time PCR软件对基因分型原始数据进行分析，并针对每个SNP位点随机选取10个样本进行Sanger测序，对TaqMan 基因分型的结果进行验证。

1.3 统计学分析

使用GraphPad Prism7.0对数据进行统计分析，使用t检验分析两组被检者的年龄差异有无统计学意义，采用χ2检验分析两组被检者的性别差异有无统计学意义，采用Hardy-Weinberg平衡检测分析对照组样本的代表性。使用SHEsis软件[16]比较4个SNP位点等位基因和基因型频率在各组中的差异有无统计学意义，并分析上述4个SNP位点之间的连锁程度；构建上述4个SNP的单倍型，并用χ2检验计算所构建的单倍型在两组被检者中的分布频率差异有无统计学意义。采用Bonferroni进行多重比较校正，由于本研究涉及4个SNP位点，当校正后P<0.0125(0.05/n,n=4)时，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 样本基本特征及代表性分析

本次研究共纳入非小细胞肺癌病例组500例和对照组613例。病例组和对照组间的年龄、性别比较差异无统计学意义(P=0.32和P=0.10)。按照病理类型分类，非小细胞肺癌病例组包含非小细胞肺癌肺腺癌(lung adenocarcinoma，AC)病例319例、肺鳞状细胞癌(lung squamous cell carcinoma，SCC)154例和其他(大细胞癌)病例27例。Hardy-Weinberg检验结果显示，CLPTM1L调控区4个SNP(rs27069、rs27070、rs27071及rs27996)的各基因型在对照组中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.916、P=0.926、P=0.29、P=0.851)，表明本研究中所收集的样本是具有群体代表性的。

2.2 CLPTM1L调控区基因4个SNP位点与非小细胞肺癌的相关性

结果显示，rs27071的等位基因和基因型频率在对照组和非小细胞肺癌组之间的差异有统计学意义(P=0.006、P=0.004)，该位点的C等位基因可能与降低的肺癌发生风险相关(OR=0.67，95%CI为0.50～0.89)；而rs27069、rs27070和rs27996位点的等位基因和基因型分布频率在非小细胞肺癌病例组和对照组之间的差异无统计学意义(P>0.0125)，提示这3个SNP位点与肺癌的发生风险可能不具有相关性。见表1。

表1 CLPTM1L基因4个SNP位点的等位基因和基因型在非小细胞肺癌组和对照组的分布频率Tab.1 The allelic and genotypic distribution of SNPs in CLPTM1L genes between the case group and the control group

2.3 CLPTM1L调控区基因4个SNP位点与非小细胞肺癌不同病理类型的相关性

CLPTM1L调控区SNP(rs27069、rs27070、rs27071和rs27996)位点在对照组和病例组AC、SCC中的等位频率和基因型频率见表2。结果显示，rs27071的C等位基因在对照组与病例组AC患者间的分布频率差异有统计学意义(P=0.006，OR=0.61，95%CI为0.43～0.87)，且rs27071位点基因型频率在AC患者与对照组间之间的差异有统计学意义(P=0.012)；而rs27071位点的等位基因和基因型在对照组与病例组SCC患者间的分布频率差异无统计学意义(P>0.0125)，提示rs27071位点的C等位更可能是非小细胞肺腺癌发生的保护性因素。

表2 CLPTM1L基因4个SNP位点的等位基因和基因型在腺癌组、鳞状细胞癌组和对照组的分布频率Tab.2 The allelic and genotypic distribution of SNPs in CLPTM1L genes among AC, SCC, and the control groups

2.4 CLPTM1L调控区基因4个SNP位点的连锁不平衡分析及单倍型构建

连锁不平衡分析显示，rs27069、rs27070、rs27071和rs27996存在强连锁(D'>0.95)，故而进一步构建了CLPTM1L调控区SNP(rs27069、rs27070、rs27071和rs27996)位点的单倍型，并分析频率>3%的单倍型在病例组和对照组中的频率差异，分析结果显示，病例组单倍型rs27069[T]-r27070[C]-rs27071[C]-rs27996[G]的分布频率与对照组相比差异具有统计学意义(P=0.006)，提示单倍型rs27069[T]-r27070[C]-rs27071[C]-rs27996[G]可能是云南汉族非小细胞肺癌发生的保护性性因素(OR=0.662，95%CI为0.493～0.890)。见表3。

表3 CLPTM1L基因4个SNP位点在非小细胞肺癌组和对照组的单倍型分析与比较Tab.3 Haplotype analysis and comparison of four SNPs in CLPTM1L between the case group and the control group

3 讨论

本文研究了CLPTM1L基因转录调控区内的四个单核苷酸多态性变异(rs27069、rs27070、rs27071和rs27996)与非小细胞肺癌发生风险的相关性，发现rs27071的C等位以及单倍型rs27069[T]-rs27070[C]-rs27071[C]-rs27996[G]与云南汉族人群非小细胞肺癌的发生风险显著相关。

之前肺癌GWAS研究及后续的重复性研究已经报道了很多CLPTM1L基因区域中与肺癌的发生风险具有显著相关性的位点，rs401681、rs402710和rs31489是其中最为显著的SNP[9-11]，然而，由于上述SNP位点均位于不太可能具有生物学功能的基因间区域[15]，因而GWAS研究鉴定到的CLPTM1L基因区域的肺癌风险信号很可能并不来自rs401681、rs402710和rs31489本身。近年来，很多研究都发现位于基因转录调控区域的 SNPs能够通过调节特定基因的表达来增加其携带者患肺癌的风险[12-14]，因而可以推测位于CLPTM1L基因的转录调控区，且与rs401681、rs402710和rs31489高度连锁的SNP更可能是该区域内真正具有功能的肺癌因果变异位点。

本研究发现位于CLPTM1L基因启动子和增强子区域的rs27071与云南汉族人群非小细胞肺癌的发生风险显著相关。2011年，Pande等[10]的研究也报道了rs27071与不吸烟者罹患肺癌的风险具有相关性，这与本研究的结果是一致的。值得注意的是，Fang等[17]使用ENCODE数据库对rs27071进行功能注释也发现rs27071位于CLPTM1L的转录调控区中。唇腭裂跨膜蛋白1样蛋白(cleft lip and palate transmembrane protein 1-like，CLPTM1L)是一种能够在肺、胰腺、卵巢和皮肤等正常组织及癌组织中广泛表达跨膜蛋白[18-20]。目前已有研究表明CLPTM1L在肺癌组织中表达升高[21]，且CLPTM1L还被报道能够影响肺癌细胞的凋亡[21]、迁移和侵袭能力[22]，因而推测rs27071可能通过改变CLPTM1L的基因表达，参与了肺癌的发生和发展进程。

2018年发表的一篇精细定位研究中，rs27996被认为是一个可能性非常大的致病性变异，因为rs27996位于CLPTM1L启动子和增强子区域中ETS1、POI2和SIX5等转录因子结合位点的核心序列中[11]，提示rs27996很可能通过影响这些转录因子与DNA序列的亲和力，影响CLPTM1L的基因表达水平，从而参与肺癌的发生。但在此次研究中，rs27996与非小细胞肺癌发生风险的关联并没有达到显著性的水平，这可能是本次实验样本量相对较小的原因导致的。

单倍型分析结果显示，CLPTM1L的单倍型rs27069[T]-rs27070[C]-rs27071[C]-rs27996[G]与降低的云南汉族人群NSCLC的发生风险相关，由于上述4个SNP位点本身均位于CLPTM1L基因的启动子或者增强子区域，因而上述4个SNP可能在调控CLPTM1L基因表达中发挥着协同效应。在之后的研究中将继续开展双荧光报告等功能性实验对CLPTM1L基因表达调控的影响做进一步探究。

综上所述，本研究发现位于CLPTM1L基因转录调控区的单核苷酸多态性变异及单倍型rs27069[T]-rs27070[C]-rs27071[C]-rs27996[G]与云南汉族人群非小细胞肺癌的发生风险显著相关。Rs27071的C等位与单倍型rs27069[T]-rs27070[C]-rs27071[C]-rs27996[G]可能是云南汉人群非小细胞肺癌发生的保护性因素，研究结果将有助于鉴定CLPTM1L基因座中的潜在功能变异位点，并为肺癌的诊断和治疗提供新的靶点。