生菜生产到消费全程金黄色葡萄球菌的定量风险评估

瞿 洋，何昭颖，周昌艳，林 婷，杜远芳，马智宏，索玉娟,

（1.上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（上海），上海 201403；2.上海科立特农产品检测技术服务有限公司，上海 201106；3.北京农业质量标准与检测技术研究中心，农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（北京），北京 100097）

过去20 年间，消费者在健康饮食方面态度和行为的转变增加了即食农产品的消费量[1]。即食是一种不经加热直接食用的饮食方式，若其食用的农产品被病原微生物污染，则会对人体健康产生一定风险。1980—2016年，全球因即食农产品共引起571 起食物中毒事件，导致72 855 人患病，其中50%的事件由即食绿叶菜引起[2]。生菜作为沙拉制作的主要菜品，是我国消费最多的一类即食蔬菜。容冬丽等[3]发现我国生菜中金黄色葡萄球菌污染率为5.9%，具有潜在的致病风险。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是我国第3大食源性致病菌[4]，一般认为其浓度大于105CFU/g（mL）时会产生耐热肠毒素，进而引发食物中毒[5-7]，出现恶心、呕吐、腹痛和腹泻等症状[8-9]。

为预防金黄色葡萄球菌食物中毒，欧美等国已将食品安全关注点从食源性疾病暴发的事后调查转移至食品污染的早期评估。微生物定量风险评估（quantitative microbial risk assessment，QMRA）运用数学和逻辑语言构建模型，定量分析危害人体健康的潜在因素，科学指导管理者制定有关管理守则，降低食品风险[9]。目前，国内外金黄色葡萄球菌定量风险评估主要集中于乳及乳制品、肉及肉制品[10-14]，果蔬相关研究较少；而生菜中金黄色葡萄球菌的研究多集中于预测模型的构建[15]，QMRA研究尚处于空白阶段。因此，定量分析即食生菜中金黄色葡萄球菌的危害，对预防该组合引起的食物中毒具有重要参考意义。

基于此，本研究从生菜种植环节入手，重点排查大棚和露地这两种常见种植方式中各环境因素及产品的污染数据，结合我国居民的消费习惯和金黄色葡萄球菌在生菜中的生长与失活模型，分析得出生菜从生产种植到供应销售及食用各模块的相关参数值，进而从危害识别、危害特征描述、暴露评估和风险特征描述4 个方面对我国生菜中的金黄色葡萄球菌进行全程定量风险评估。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

土壤、肥料和灌溉水样本来自上海和北京地区143 家生菜种植基地（大棚及露地），其中大棚样本：土壤51 份、灌溉水44 份、肥料27 份；露地样本：土壤92 份、肥料20 份、灌溉水25 份。所有样本均在2 h内送达实验室。

7.5 %氯化钠肉汤、血琼脂平板、Baird-Parker（BP）培养基、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）、兔血浆 北京陆桥技术有限责任公司；氯化钠上海博蕴生物科技有限公司；脑心浸出液肉汤 英国Oxoid公司。

1.2 仪器与设备

SX-500高压灭菌锅 日本Tomy Digital Biology公司；1300 SERIES A2型生物安全柜 美国Thermo公司；Medcenter Einrichtungen GmbH恒温培养箱 德国Friocell公司；AL104电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；Vortex Genie 2旋涡混匀仪 美国Scientific Industries公司。

1.3 方法

依据国际食品法典委员会颁布的C A C/G L-3 0（1999）《微生物风险评估原则和指南》，对生菜中的金黄色葡萄球菌从危害识别、危害特征描述、暴露评估和风险特征描述4 个方面进行定量风险评估。

危害识别、危害特征描述：通过查阅相关专著、教材、国内外文献或评估报告，收集金黄色葡萄球菌的危害特征资料。

暴露评估：从生菜种植生产环境中金黄色葡萄球菌的初始污染水平开始，以食用消费者发病率结束，涉及生菜种植、供应链、销售及食用环节。按照GB 4789.10—2016《食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》中MPN计数法[16]对土壤、肥料和灌溉水进行定量检测，本实验中假设单位MPN可与CFU互换；金黄色葡萄球菌生长数据：生菜中金黄色葡萄球菌的二级生长模型参考本课题组前期研究（μmax=0.021×（T－14.958）[1－e5.175（T－40.193）]，其中μmax表示最大比生长速率/h－1；T表示温度/℃；λ=0.024 23T2－1.979 32T＋42.124 97，其中λ表示迟滞期/h；T表示温度/℃）；其他数据参考文献[1,11-12,17-25]。暴露评估模型采用拉丁超立方抽样方法进行蒙特卡洛模型模拟，模型每次模拟包括10 000 次迭代运算，每次运算时计算机从模型每个概率分布中抽取1 个值，以这些随机抽取的数值进行运算。

风险特征描述：在危害识别、危害特征描述、暴露评估的基础上，考虑不确定性因素，确定人群即食含有金黄色葡萄球菌污染的生菜引起疾病的概率，评估结果以每年即食生菜导致金黄色葡萄球菌中毒的人数表示，并通过敏感性分析，提出合适的风险管理措施。

1.4 数据统计分析

应用Microsoft Excel 2010软件进行检测数据的统计及风险特征描述，用@Risk 5.5软件的分布拟合功能对暴露评估数据进行随机分布拟合统计分析。

2 结果与分析

2.1 危害识别

金黄色葡萄球菌为无芽孢和鞭毛的革兰氏阳性菌，生长温度范围为6.5～50 ℃，最适生长温度37 ℃，能在pH 4.5～9.3条件下生长，最适pH 7.4。金黄色葡萄球菌对热、干燥及高渗环境具有较高抗性[26-27]，可产生大量的胞外酶和代谢产物。一些菌株产生的耐热肠毒素（在100 ℃、30 min条件下仍有活性），可引起金黄色葡萄球菌感染或食物中毒[28]。2017年中国食源性疾病暴发事件监测资料显示，金黄色葡萄球菌肠毒素食物中毒事件仅少于副溶血性弧菌和沙门氏菌[1]。

2.2 危害特征描述

金黄色葡萄球菌产生肠毒素引起的食物中毒症状出现较快，一般为2～8 h，包括恶心、呕吐或干呕，腹部痉挛、发汗、发冷、衰竭、脉软、休克、呼吸弱和低温等症状，伴有腹泻或无腹泻症状[26-27]。剂量-反应曲线的终点以急性胃肠疾病的发病界定。国际公认的金黄色葡萄球菌肠毒素阈值为1.0 μg[22]，一般认为食物中金黄色葡萄球菌含量达到105CFU/g即可达到上述毒素量，本次评估以105CFU/g作为金黄色葡萄球菌食物中毒的阈值标准。

2.3 暴露评估

2.3.1 生菜种植环节中各环境样本的污染情况

2019—2020年上海和北京地区大棚及露地生菜种植过程中土壤、肥料、灌溉水中金黄色葡萄球菌含量的监测数据显示，大棚种植环境中51 份土壤有1 份阳性检出，阴性样本为50 份；44 份灌溉水和27 份肥料中金黄色葡萄球菌均未检出；露地种植模式下，92 份土壤、20 份肥料和25 份灌溉水均无金黄色葡萄球菌检出，故本次评估主要以大棚生菜为主。

以Beta（np＋1，nn＋1）分布形式表示土壤中金黄色葡萄球菌的初始污染率，其中np为阳性样本数，nn为阴性样本数，即土壤中金黄色葡萄球菌的初始污染率Pp为Beta（2，51），阴性污染率Pn为1－Pp。按照最大保护原则，土壤阳性样本中金黄色葡萄球菌数Lp为3.04（lg（CFU/g）），根据Jarvis[29]所述公式估计阴性样本中金黄色葡萄球菌污染水平Ln平均值，由其反向偏斜累计概率分布表示。最终，以离散函数Discrete（Lp∶Ln，Pp∶Pn）描述土壤中金黄色葡萄球菌的初始污染水平，结果见图1，其90%置信区间的污染率变化范围为－8.72～3.01（lg（CFU/g）），平均值为－2.87（lg（CFU/g））。

图1 土壤中金黄色葡萄球菌的污染水平分布模拟Fig.1 Fitted distribution of S.aureus contamination level in soil

2.3.2 生菜种植过程中金黄色葡萄球菌的变化

种植过程主要关注灌溉及采收引起大棚生菜中金黄色葡萄球菌污染水平的变化，假设种植过程中生菜上的金黄色葡萄球菌不生长，各阶段金黄色葡萄球菌的污染水平见图2。

图2 生菜种植过程中各阶段金黄色葡萄球菌的污染水平分布模拟Fig.2 Fitted distribution of S.aureus contamination level in lettuce plantation

大棚生菜一般采用自来水或地下水进行灌溉，灌溉方式有喷灌和滴管两种，较为常见的为喷灌，故本研究选择喷灌方式进行后续计算。根据30 家生菜基地的调研结果及生菜种植文献[17-18]，生菜的平均灌溉周期为8 d（90%置信区间6.20～9.80 d）；在使用喷灌灌溉生菜时，会有0.28（5%）～0.52（95%）的概率出现水溅现象，导致每克生菜增加0.06（5%）～15.36 g（95%）土壤。灌溉后，生菜中金黄色葡萄球菌的污染水平为－8.95（5%）～2.86（lg（CFU/g））（95%），平均值－3.07（lg（CFU/g））。

生菜通常使用刀具进行收割，该步骤使每克生菜增加了－0.008～0.002（lg（CFU/g））（90%置信区间）金黄色葡萄球菌。生菜采收后，金黄色葡萄球菌的污染水平为－8.95～2.86（lg（CFU/g））（90%置信区间），平均值为－3.07（lg（CFU/g））。

2.3.3 生菜从市场到餐桌过程中金黄色葡萄球菌的变化

2.3.3.1 销售至家庭贮藏过程中生菜暴露温度和暴露时间的概率分布

生菜从市场到餐桌主要历经：农田到市场的运输、市场销售、市场到家庭的运输、家庭贮藏4 个环节，各环节温度和时间的概率分布如表1所示。运输和市场销售部分通常为常温，采用Triang（－17.6，28，31.8）函数拟合全国气温分布，从拟合结果可以看出，常温下全国平均气温为14.07 ℃，90%置信区间为－6.99～28.74 ℃。消费者调研结果显示，生菜贮藏有常温贮藏也有冷藏贮藏，假设其比例为1∶1，参考文献[22]使用函数Uniform（0，8）拟合冰箱冷藏室贮藏温度，最终家庭贮藏拟合温度平均值为8.99 ℃，90%置信区间为－2.72～27.37 ℃。生菜从农田到市场的运输时间为8.32（5%）～20.71 h（95%），平均值为14 h；市场销售时间参考文献[1,21]结合我国市场实情进行模拟校正，其范围为4.18（5%）～20.24 h（95%），平均值为12.17 h；市场到家庭的运输时间为0.58（5%）～1.93 h（95%），平均值为1.25 h；家庭贮藏时间依据最大化原则，以冰箱冷藏时间为主，即生菜家庭贮藏时间为3.60～68.40 h，平均值为36.00 h。

表1 销售至家庭贮藏过程中生菜暴露温度和暴露时间的概率分布Table 1 Possibility distribution of exposure time and temperature during transportation and storage

2.3.3.2 销售至家庭贮藏过程中生菜金黄色葡萄球菌的变化

生菜从农田到市场的运输、市场销售、市场到家庭的运输均在常温下进行，故3 个阶段μmax和迟滞期相同，μmax平均值为－0.018 h－1（90%置信区间为－0.461～0.289 h－1），迟滞期平均值为22.13 h（90%置信区间为5.3～57.1 h）；家庭贮藏环节中μmax平均值为－0.124 h－1（90%置信区间为－0.374～0.261 h－1），迟滞期平均值为24.23 h（90%置信区间为－12.1～47.7 h）。

由图3可知，在农田到市场的运输中，生菜中金黄色葡萄球菌数为－8.60（5%）～3.52（lg（CFU/g））（95%），平均值为－2.42（lg（CFU/g））；市售生菜中金黄色葡萄球菌数为－8.17（5%）～4.14（lg（CFU/g））（95%），平均值为－1.93（lg（CFU/g））；购买回家时生菜中金黄色葡萄球菌的污染水平与市售生菜一致；经过家庭贮藏，清洗前生菜中金黄色葡萄球菌数为－7.78（5%）～5.63（lg（CFU/g））（95%），平均值为－0.75（lg（CFU/g））。

图3 销售至家庭贮藏过程各阶段生菜中金黄色葡萄球菌的污染水平分布模拟Fig.3 Fitted distribution of S.aureus contamination level in lettuce from sale to home

2.3.3.3 生菜食用环节及发病概率计算

生菜食用前清洗环节的细菌减少量数据来源于文献[23-24]，采用Uniform（0.39，2）概率分布模型描述生菜表面金黄色葡萄球菌在流水冲洗2 min内的细菌变化规律，其中，90%置信区间下细菌减少量为0.47～1.92（lg（CFU/g））。如图4所示，食用前生菜中金黄色葡萄球菌的终污染水平为－8.98～4.40（lg（CFU/g）），平均值为－1.95（lg（CFU/g））。

图4 食用前生菜中金黄色葡萄球菌的污染水平分布模拟Fig.4 Fitted distribution of S.aureus contamination level in lettuce before consumption

我国居民即食生菜的消费习惯及数量参考文献[25]，即每人每天即食生菜消费量为9.06 g，90%置信区间为0.1～34.4 g，计算得出每个消费者每天摄入即食生菜感染金黄色葡萄球菌总数为－2.09（lg（CFU/g）），90%置信区间为－9.27～4.53（lg（CFU/g））（图5）。

图5 消费者每天食用即食生菜时摄入的金黄色葡萄球菌量Fig.5 Daily per capital intake of S.aureus from consumption of raw lettuce

剂量-反应关系用于描述人体摄入致病菌的数量与居民患病概率的关系，本研究参考文献[11]采用指数模型P=1－er×N（r表示单一金黄色葡萄球菌引起食物中毒的概率，N表示摄入金黄色葡萄球菌的数量），评估即食生菜中金黄色葡萄球菌对人体健康的危害。根据食用前生菜中金黄色葡萄球菌的污染水分布结合我国居民即食生菜消费水平，预测因即食生菜导致发生金黄色葡萄球菌病的概率见图6，其平均值为2.72×10－4。

图6 食用即食生菜导致金黄色葡萄球菌发病概率预测分布图Fig.6 Incidence probability of S.aureus infection from consumption of raw lettuce

2.3.3.4 暴露评估过程中主要参数汇总

生产到消费全程生菜中金黄色葡萄球菌的暴露评估模型参数详见表2。

表2 生菜中金黄色葡萄球菌从农田到餐桌的暴露评估模型参数Table 2 Summary of variables and parameters of S.aureus exposure assessment models for lettuce of from farm to table

续表2

2.4 风险特征描述

通过暴露评估输出数据结合剂量-反应模型计算即食生菜引起的金黄色葡萄球菌病的风险。本模型主要计算即食生菜人口，假设其占我国总人口数1%，通过暴露人数计算我国每年因即食生菜而引起金黄色葡萄球菌患病人数超过77万（表3）。

表3 我国每年因即食生菜而引起金黄色葡萄球菌患病预期年度风险计算Table 3 Calculation of expected annual risk of S.aureus infection caused by consumption of raw lettuce

2.5 敏感性分析

通过各变量与模型暴露评估结果的Spearman相关性进行敏感性分析，相关系数在－1～1之间，1表示正相关，－1表示负相关，相关系数越接近0表示该因子与模型评估结果的相关性越低。通过相关性分析找到对模型影响最大的变量因素，从而帮助决策者运用有效的风险控制管理措施和手段对主要风险进行控制，降低食品中致病菌的安全风险。

如图7所示，生菜种植时土壤中金黄色葡萄球菌的初始污染水平对生菜中金黄色葡萄球菌的污染水平影响最大（相关系数0.75），其次是家庭贮藏温度（相关系数0.40），清洗、从农田到市场的运输温度、灌溉时土壤转移质量、即食生菜食用频次和市场销售温度（相关系数绝对值为0.1～0.2）。即食生菜摄入量、市场销售时间、家庭贮藏时间、农田到市场的运输时间、灌溉时间及灌溉时金黄色葡萄球菌转移概率对生菜中金黄色葡萄球菌的污染水平影响效果有限（相关系数绝对值小于0.1）。

图7 各环节中金黄色葡萄球菌风险的敏感性分析Fig.7 Sensitivity analysis for S.aureus infection in each step

3 讨论

本研究定量风险评估结果显示，我国每年因即食生菜引发的金黄色葡萄球菌中毒概率为2.72×10－4，每年因此导致的金黄色葡萄球菌中毒人数约为77万。中毒概率与蔡华等[22]预测的上海市凉拌菜中金黄色葡萄球菌引起的食物中毒概率（4×10－4）相似；中毒人数稍大于其预测人数51.81万 人，并且大于国家突发公共卫生事件报告管理系统显示2019年因金黄色葡萄球菌引起的食物中毒人数（1 023 人）[30]。造成中毒人数存在较大差异的主要原因除与模型自身偏差有关外，也与我国食源性疾病监测统计数据的缺失与不完善等情况有较大关系[31]。

由于我国食品微生物定量风险评估处于快速发展阶段，本次评估的不确定性主要来源于参数的不确定性和统计的不确定性。首先，本次评估中部分数据处于缺失状态，如即食生菜的消费习惯及数量使用即食食物的数据进行替代；种植环节中金黄色葡萄球菌的转移率使用大肠杆菌O157的数据进行替代，使用上海和北京两地数据替代全国数据；其次，生菜及其环境的阳性样本浓度较低，采用MPN法进行检测，后续计算将MPN/g等同于CFU/g。因此，要推动我国食源性致病菌定量风险评估的发展，必须补充完善各环节相应基础数据以提高定量风险评估的准确性。

在对食用前生菜中金黄色葡萄球菌的评估结果进行敏感性分析过程中发现：1）生菜种植过程中，土壤中金黄色葡萄球菌的初始污染水平对其影响最大，因此控制生菜种植环境的卫生状况是预防即食生菜金黄色葡萄球菌中毒的关键。此外，就大棚和露地两种种植方式而言，露地种植生菜中金黄葡萄球菌污染较少，可能与阳光照射下的紫外线杀菌作用有关[32]。2）运输温度、销售温度及家庭贮藏温度对评估结果影响较大，特别是家庭贮藏温度。一般来说，温度越高，微生物细胞膜流动性越强，运输营养物质能力越快，越有利于微生物的生长[33]。3）清洗过程会减少生菜中的金黄色葡萄球菌。资料显示，常见的家庭清洗方式最多可减少果蔬表面2（lg（CFU/g））的微生物[34]。

基于本研究结果，为防控即食生菜引起金黄色葡萄球菌食物中毒，建议从以下方面进行重点管控：1）从源头控制生菜中金黄色葡萄球菌的污染水平，倡导有条件的基地覆盖地膜，选用滴灌方式进行灌溉；2）生菜购买后应及时食用或者于冰箱冷藏，减缓金黄色葡萄球菌的生长，控制生菜贮存时间；3）加强厨房卫生习惯宣传，避免食物交叉污染，注意科学清洗生菜。

4 结论

监测生菜种植过程中土壤、肥料、灌溉水中金黄色葡萄球菌数量，评估生菜中金黄色葡萄球菌从种植、销售到即食的动态变化及风险情况，预测我国因即食生菜导致金黄色葡萄球菌中毒的概率为2.72×10－4，每年因此引发的食物中毒病例约为77万 人，同时发现土壤中金黄色葡萄球菌的初始污染水平对生菜中金黄色葡萄球菌的污染水平影响最大，其次为家庭贮藏温度及食用前清洗过程，提出从控制生菜种植环境、合理使用冰箱及清洗生菜3 方面降低即食生菜引起金黄色葡萄球菌中毒风险，为生产企业和监管部门制定标准提供准确的理论依据。