野生垂穗披碱草种质资源UV-B抗性综合评价

邱文静，陈仕勇，罗 鑫，李英主，李欣瑞，毛德才，鄢家俊，游明鸿，李达旭，白史且*，常 丹*

(1. 西南民族大学，四川 成都 610041； 2. 四川省草原科学研究院，四川 成都 611731)

地球表面的紫外辐射根据波长可分为短波、中波和长波紫外辐射。波长在280～320 nm的紫外光称为Ultraviolet-b radiation(UV-B radiation)，约占太阳辐射总量的1.5%[1]，其可对生物和生态造成严重的影响[2]。臭氧层有“地球保护伞”之美誉，它能大量吸收波长较短的太阳紫外辐射，从而保护地球上的生物不受辐射的伤害[3]。近年来，现代工业的快速增长，以及人类其他的一些不合理活动，导致空气中氯氟烃、氧化氮等大气污染物的排放增多，破坏了臭氧层[4]，使得到达地球表面的UV-B中波紫外辐射增强。UV-B辐射使草地植物遭受胁迫、草地资源遭到破坏，草地生产力急剧下降，其产生的影响已成为备受各国关注的重大环境问题之一[5]。

垂穗披碱草(Elymusnutans)是禾本科(Poaceae)小麦族(Triticeae)披碱草属(Elymus)的一种多年生疏丛型六倍体物种，染色体组成为StStHHYY(2n=6x=42)[6-7]，在我国主要分布于北方、西北、西南地区，是青藏高原地区重要的优势种和建群种[8]。垂穗披碱草具有发达的根系，在水土保持与荒漠化防治、促进草地生态恢复方面具有重要作用[9]，是青藏高原高寒牧区人工草地建植和草原生态恢复的重要草种[10]。垂穗披碱草还具有适应性强、营养价值高、产量高、适口性好、粗蛋白含量高等特点[11]，有着极强的抗逆性，如抗寒、抗旱、抗病、耐盐碱等麦类作物所缺乏的优良抗逆基因[12]，且能在其他麦类作物罕见的高海拔高紫外强度地区生存，具有抗UV-B辐射能力强的潜质。近年来，有关环境因素对垂穗披碱草影响的研究主要集中在温度[13-14]、盐分[14]以及干旱[15]胁迫等方面，关于垂穗披碱草抗UV-B辐射方面的研究较少。因此加强垂穗披碱草抗UV-B草品种的选育，对我国生态环境建设以及畜牧业的发展具有重大意义。由此，本试验以引自不同地区、不同海拔的9份野生垂穗披碱草为研究对象，通过测定各生长指标、生理指标，比较UV-B辐射下不同材料的抗UV-B能力差异，从中初步筛选出抗性较强的材料，为垂穗披碱草抗UV-B辐射能力强的新品种选育与利用提供材料基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料(表1)为来自我国内蒙古、河北、新疆、青海、甘肃、四川、西藏的9份野生垂穗披碱草种质资源，2018年移栽于四川省草原科学研究院红原基地种质资源圃。

表1 野生垂穗披碱草种质材料信息Table 1 Information of wild Elymus nutans germplasm

1.2 试验设计

材料培养采用盆栽法。将9份材料移栽于花盆中(烘干土∶营养土∶蛭石=3∶4∶1.5，花盆口径×高=16 cm×16 cm)，每份材料种植18盆，每盆种1个单株。移栽后每天浇水管理，保证植株正常生长，生长3个月后于苗期进行UV-B辐射处理。试验于四川省草原科学研究院实验室内进行。将试验材料全部置于紫外灯柜中，试验温度控制为20℃，光周期设置为光照12 h，黑暗12 h。为保证光质稳定性，UV-B荧光灯管用0.125 mm厚的二醋酸纤维素薄膜包裹滤除UV-C，每天10∶30—14∶30使用UV-B荧光灯进行辐射，强度约为200 μw·cm-2(模拟高原紫外强度的105%)，其余时间为正常光照。UV-B辐射强度采用紫外辐照计(北京师范大学光电仪器厂)在植株顶端进行测量。分别于紫外辐射第0，3，6，9，15，21 d进行取样。在每个时间节点下，分别从各材料中选择3盆长势基本一致的作为3个重复，取样时间为下午15∶00—17∶00，样品用锡纸包裹，液氮迅速冷冻后，放入—80℃低温冰箱保存用于后期生理指标的测定。

1.3 测定指标及方法

1.3.1生长发育指标 叶片伤害等级采用拍照及观察记录法；生理指标的测定每个样品重复3次。

相对含水量(Relative water content,RWC)采用饱和称重法测定：称取0.2 g新鲜叶片，记录为鲜重(Fresh weight,FW)；再放入蒸馏水浸泡12 h后擦干称得饱和恒重(Constant weight，CW)；最后放入80℃烘箱烘干24 h后称其干重(Dry weight，DW)。叶片相对含水量的计算公式：RWC%=(FW—DW)/(CW—DW)×100%。

1.3.2细胞膜系统指标 叶片电导率(Electrical conductivity，EL)采用电导法测定：称取0.1 g叶片，使叶片完全浸泡于去离子水中12 h后用电导率仪测得电导值S1，之后100℃水浴0.5 h，冷却后测得S2。电导率计算公式：EL%= S1/S2 ×100%。

丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法测定[16]。

1.3.3渗透调节系统指标 可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定[5]；脯氨酸含量采用试剂盒的茚三酮比色法测定[17]。

1.3.4抗氧化系统指标 总抗氧化能力采用试剂盒的DPPH法测定，向DPPH溶液中加入抗氧化剂时，会发生脱色反应，因此可用吸光度的变化并以Trolox作为对照体系量化抗氧化物质的抗氧化能力。

谷胱甘肽过氧化物酶活性采用试剂盒测定，通过测定340 nm光吸收减少速率来计算GSH-Px活性；抗坏血酸过氧化物酶活性采用试剂盒测定，APX催化H2O2氧化AsA，通过测定AsA氧化速率，来计算得APX活性。类黄酮含量采用试剂盒测定，在碱性亚硝酸盐溶液中，类黄酮与铝离子形成在510 nm处有特征吸收峰的红色络合物，测定样品提取液在510 nm处的吸光值，即可计算样品类黄酮含量。

1.3.5次生代谢物指标 花青素含量采用单波长比色法，花青素在520 nm有最大吸光值，采用酸性乙醇溶液提取，单波长比色法测定花青素含量。PSII最大光化学效率采用CF Imager叶绿素荧光成像系统测定，将选定的叶子充分暗适应120 min，测定其PSII原初光化学效率。叶绿素含量利用SPAD-502Plus便携式叶绿素计测定，每盆材料选择5片成熟叶片进行测定并求其平均值，检测结果为Spad指数表示。

1.4 数据处理与分析

试验数据采用Excel 2016处理之后，用SPSS 21.0专业统计分析软件进行方差分析，分析图采用Origin 2021完成。本研究中，若指标与抗UV-B能力呈正相关关系，则将所有指标的处理组原始数据代入隶属函数公式；若指标与抗UV-B能力呈负相关关系，则代入反隶属函数公式，得到各指标的具体隶属函数值，并进行累加，求取平均值，即得出各供试材料的抗UV-B辐射隶属函数平均值。隶属函数均值越大，抗UV-B能力越强。同时，对9份垂穗披碱草材料的隶属函数平均值进行排序。

隶属函数公式：

R(Xij)=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

反隶属函数公式：

R(Xij)=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

式中R(Xij)表示供试材料i指标j的抗UV-B隶属函数值，Xij表示供试材料i指标j的紫外胁迫指数，Xjmin和Xjmax分别表示各指标的最大值和最小值。在本试验中，除丙二醛和电导率2个指标采用反隶属函数公式计算函数值外，其余指标均采用隶属函数值公式计算函数值。

2 结果与分析

2.1 UV-B辐射对垂穗披碱草各指标的影响

2.1.1生长发育指标 辐射处理后，9份材料的叶片均出现变化。如叶缘褪绿、叶片出现萎蔫及死斑现象、叶片卷曲、枯萎等。在胁迫第6 d时，材料SC020和NM037的叶片开始出现萎蔫现象，其余的材料表现为叶缘褪绿；在胁迫第21 d时，材料QH009的叶片仅开始出现萎蔫现象，而其余的材料均表现为叶片萎蔫带有死斑甚至枯萎。可以看出，随着胁迫加深，叶片受损程度加剧，而材料QH009整体表现较好(图1)。UV-B辐射下9份材料的相对含水量均低于第0 d，且随着辐射程度的加剧，材料QH009的相对含水量下降趋势较稳定，下降幅度较小，即使在胁迫第21 d，其含水量仍达87.6%，而其余材料的相对含水量下降幅度则较大。综合来看，本研究中，UV-B辐射胁迫下各材料的叶片相对含水量降低、持水力减弱，均受到胁迫伤害(表2)。

图1 UV-B辐射对垂穗披碱草叶片的影响Fig.1 Effects of UV-B radiation on leaves of Elymus nutans

表2 UV-B辐射对垂穗披碱草生长发育指标的影响Table 2 Effects of UV-B radiation on Growing development indexes of Elymus nutans

2.1.2细胞膜系统指标 UV-B辐射处理后，9份材料的丙二醛含量和电导率均较第0 d有所升高。在胁迫第21 d时，9份材料的丙二醛含量均达到最大值，此时，材料XZ010的含量最高，达71.04 nmol·g-1，显著高于其余材料(P<0.05)。9份材料的电导率均在胁迫第15 d或21 d时达到最大值，此时，材料SC020,XZ010的电导率显著高于其余材料(P<0.05)。综合来看，在本研究中，各材料的细胞膜均受到伤害，但程度轻重有所不同，从而影响自身的生长发育(表3)。

表3 UV-B辐射对垂穗披碱草细胞膜系统指标的影响Table 3 Effects of UV-B radiation on cell membrane system indexes of Elymus nutans

2.1.3渗透调节系统指标 UV-B辐射处理后，9份材料的可溶性糖和脯氨酸含量均较第0 d有所增加。在胁迫第21 d时，9份材料的可溶性糖含量均达到最大值，此时，材料QH009的含量最高，达9.37 mg·g-1，显著高于其余材料(P<0.05)。脯氨酸含量均在胁迫第15 d或21 d时达到最大值，其中，材料QH009的脯氨酸含量在胁迫第21 d达46.73 μg·g-1，而材料NM037的脯氨酸含量最低，只有29.47 μg·g-1，显著低于其余材料的最大值(P<0.05)。综合来看，在本研究中，各材料的渗透调节物质含量均有积累，个别材料的积累比其他材料多，有助于维持自身正常生长(表4)。

表4 UV-B辐射对垂穗披碱草渗透调节系统指标的影响Table 4 Effects of UV-B radiation on osmotic regulation system indexes of Elymus nutans

2.1.4抗氧化系统指标 UV-B辐射处理后，9份材料的总抗氧化能力均呈现出先升高后降低的趋势，均在胁迫第9 d时达到最大值，此时，材料QH009的总抗氧化能力最高，且在之后的胁迫过程中，该材料的总抗氧化能力均显著高于其余材料(P<0.05)。GSH-Px活性随着胁迫的加深均较第0 d有所降低，在胁迫第0 d到第6 d时，材料QH009的酶活性显著高于其余材料(P<0.05)；在胁迫第9 d时，材料SC020,GS007,QH011,NM037的酶活性显著低于其余材料(P<0.05)。APX活性随着胁迫程度的加深均较第0 d有所升高，材料QH009的酶活性在胁迫第6 d之后均较高，而材料SC020的酶活性则较低。综合来看，在本研究中，9份材料的抗氧化系统指标变化情况基本表现一致，个别材料的抗氧化能力和酶活性均较高，能够很快地在抗氧化调节机制中起作用(图2)。

图2 UV-B辐射对垂穗披碱草抗氧化系统指标的影响Fig.2 Effects of UV-B radiation on Antioxidant system indexes of Elymus nutans

2.1.5次生代谢物指标 UV-B辐射处理后，9份材料的类黄酮和花青素含量总体呈现出先增加后减少的趋势。在胁迫第9 d时，材料QH009的类黄酮含量达到最大值，显著高于其余材料的最大值(P<0.05)；在胁迫第21 d时，材料NM037的类黄酮含量最低，显著低于此天数下其余材料的类黄酮含量且显著低于其第0 d含量(P<0.05)。在胁迫第9 d时，材料GS005，QH009，XJ027等材料的花青素含量达到最大值，显著高于其余材料的最大值(P<0.05)；材料NM037的花青素含量在第6 d时达到最低，显著低于其余材料的最低值(P<0.05)；在整个胁迫过程中，材料QH009的花青素含量总体较高。综合来看，在本研究中，个别材料中类黄酮和花青素的积累较多，次生代谢物质的积累可以保护植物免受光合损伤，从而保护自身免受伤害(图3)。

图3 UV-B辐射对垂穗披碱草次生代谢物指标的影响Fig.3 Effects of UV-B radiation on secondary metabolites indexes of Elymus nutans

2.1.6光合特性指标 辐射处理后，9份材料的PSII最大光化学效率(Fv/Fm)和叶绿素含量均较第0 d有所降低。在胁迫第21 d时，9份材料的Fv/Fm值达到最低，此时材料HB013，NM037，XJ027，GS007的Fv/Fm值显著低于其余材料(P<0.05)。在胁迫第21 d时，9份材料的叶绿素含量也达到最低，此时，材料NM037的叶绿素含量显著低于其余材料(P<0.05)，且在整个胁迫过程中，该材料的叶绿素含量均显著低于其余材料(P<0.05)。综合来看，在本研究中，各材料的光合特性指标均受到胁迫影响，从而影响它们进行光合作用，阻碍自身正常生长(图4)。

图4 UV-B辐射对垂穗披碱草光合特性指标的影响Fig.4 Effects of UV-B radiation on photosynthetic characteristic indexes of Elymus nutans

2.2 垂穗披碱草抗UV-B辐射能力综合评价

利用模糊数学的隶属函数值法对有效指标进行分析，该方法可以在综合多个指标测定结果的基础上，对植物的抗性进行全面评价，隶属函数值的平均值越高，说明抗UV-B辐射能力越强。垂穗披碱草抗UV-B辐射能力综合评价顺序为：QH009>XJ027=HB013>GS005>GS007>QH011>XZ010>SC020>NM037(表5)。

表5 UV-B辐射下9份垂穗披碱草生理指标的隶属函数值及排序Table 5 Subordinative values of physiological parameters and order of Elymus nutans under UV-B radiation

续表5

2.3 垂穗披碱草抗UV-B辐射能力聚类分析

聚类分析可以明确垂穗披碱草资源的不同类型，方便筛选优异资源以及选取差异较大的种质材料，为亲本的选择提供理论依据。将9份材料12个指标通过平均联结法(组间)进行综合聚类分析，当欧式距离为15时，可将9份供试材料聚合划分为3类:第一类是QH009；第二类是XZ010和NM037；第三类是XJ027，HB013，GS005，GS007，QH011以及SC020。从此聚类分析结果可以看出，抗UV-B辐射能力分类结果与利用模糊数学的隶属函数法进行的综合评价结果基本一致，材料QH009表现优异，为强抗UV-B辐射材料(图5)。

图5 垂穗披碱草抗UV-B辐射能力聚类分析Fig.5 Cluster analysis of UV-B radiation resistance of Elymus nutans

3 讨论

植物在受到环境胁迫时，最直接的表现为形态发生变化，而叶片又是植物感受光照的主要器官，因此植物在受到UV-B辐射时，最敏感的部位就是叶片。研究发现，随着辐射强度和时间的增加，植物叶片会出现褪绿、萎蔫、黑斑、枯黄卷曲和脱落现象[18-19]。本研究中，UV-B辐射处理后，9份材料的叶片均出现以上现象并表现出不同程度的变化。

研究发现，植物细胞膜系统是UV-B辐射的直接靶位点，对逆境的反应较为敏感[20]。丙二醛是逆境条件下氧自由基膜质过氧化的主要产物，是衡量细胞膜结构受损程度的重要指标[21]。逆境条件下植物细胞膜系统受损，膜透性增大，内容物外渗，电导率升高。比较同一植物不同品种在同一胁迫条件下的电导率，能够很好地反映出品种间的抗逆性差异[22]。本研究中，9份材料的丙二醛含量和电导率相对于CK对照组均有不同程度的升高，这与刘茜等[23]、吴兵等[24]的研究结果一致。

植物渗透调节系统在维持自身生长发育方面起着关键作用，植物在受到逆境胁迫时，会主动积累渗透调节物质来应对这种胁迫[25]。本研究中，9份材料的可溶性糖和脯氨酸含量均随着UV-B辐射程度的加剧而不断积累，表明垂穗披碱草对UV-B辐射做出积极响应，这与王生耀等[26]、王茹丹[5]、郭巍[27]的研究结果一致。材料QH009的可溶性糖、脯氨酸含量较其他材料积累的多且变化明显，可见其抗UV-B辐射能力较强。

通常植物对逆境胁迫的抵抗能力与体内的抗氧化酶活性和总抗氧化能力也密切相关。在正常情况下，植物体内的ROS处于动态平衡，但在逆境下，ROS代谢失衡引起细胞损伤[28]。GSH-Px和APX以及其他酶类相互协调，有效地清除植物体内的活性氧，保护生物膜免受ROS的损害，维持细胞的正常功能[29]。本研究中，材料QH009的抗氧化酶活性和总抗氧化能力均高于其他材料，能够提高植物清除ROS的能力，很快地在抗氧化调节机制中起作用。这与杨薇[30]、陈拓等[31]、吴兵等[32]的研究结果一致。

类黄酮和花青素是植物体内重要的次生代谢物质，具有清除自由基的作用，在植物的生长发育、生理生化代谢以及抗性育种中具有重要作用[33]。逆境胁迫下，植物会积极改变生存策略来适应这种胁迫[19]。研究表明，UV-B辐射下，这些黄酮类化合物的积累能够使其合成基因参与到植物保护过程，使植物免受伤害[34]。黄酮类化合物可以通过减弱叶表皮中的UV-B辐射，从而减少叶片内部的损伤来保护植物。本研究中，UV-B辐射能够显著增加材料QH009的类黄酮和花青素含量，这与苏本卿[2]、彭祺和周青[35]、Zhou等[36]的研究结果一致。可见，材料QH009对UV-B辐射更耐受。

4 结论

综上，UV-B辐射不同程度地影响着9份材料的生长发育特性、生理特性。结果表明，次生代谢物指标对UV-B辐射的响应最为明显，是评价UV-B抗性强弱的主要因素。QH009受UV-B辐射的影响最小，表现最优异，该材料可作为垂穗披碱草新品种选育与利用的基础材料。