西藏野生垂穗披碱草对温度和水分的生理响应

周 晶1， 王传旗， 包赛很那， 王小川， 梁 莎， 苗彦军

(1.中交和美环境生态建设有限公司， 湖北 武汉 430052； 2.西藏农牧学院， 西藏 林芝 860000)

干旱是一个长期存在的全球性问题，受到广泛关注[1]。有着“世界屋脊”和“地球第三极”之称的西藏，由于喜马拉雅山脉阻挡了来自印度洋暖湿气流的进入，加上全球气候变暖以及青藏高原的隆升，西藏地区的干旱情况越来越严重，已成为严重限制西藏地区牧草产量及其品质的关键因素。因此，抗旱性草种的开发利用成为西藏地区半人工草地及人工草地种植的关键。 垂穗披碱草(ElymusnutansGriseb.)为禾本科披碱草属牧草，是西藏高寒草甸植被群落中具有代表性的禾本科草种之一[2]。其生态适应性广，具有保持水土、抗旱、耐寒等优点[3]，在保护生态环境方面具有重要的意义。目前，垂穗披碱草已成为西藏地区栽培草地最适宜的草种之一，同时也是西藏地区乡土禾草种质资源重点开发利用的对象。严青等研究发现，在PEG浓度为5%时，垂穗披碱草相对萌发率呈下降趋势[4]；卢素锦等研究认为，随着干旱胁迫天数的增加，叶绿素含量呈下降趋势而丙二醛和可溶性糖含量都显著增加[5]。本试验以西藏申扎县野生垂穗披碱草为研究对象，探讨了不同干旱胁迫强度和连续干旱胁迫天数对其种子萌发和幼苗生长的影响，以及可能的生理机制，研究结果将为西藏乡土禾草种质资源的开发利用和抗旱性鉴定提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料于2015年9月采自西藏那曲区申扎县(30°56′N，88°45′E，海拔4 793 m)，阴坡、沙壤。

1.2 试验方法

选取籽粒饱满、大小均一、成熟的种子，用2%NaClO溶液浸种15 min，然后用超纯水冲洗干净备用[6]。

1.2.1温度试验设置

恒温设置为10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃和30 ℃，变温设置为10 ℃/20 、15 ℃/25 ℃、20 ℃/30 ℃、25 ℃/35 ℃。

1.2.2干旱试验设置

配制0(ck)，0.05，0.10，0.15 g·mL-1和0.20 g·mL-1等质量浓度的聚乙二醇(PEG-6000)溶液，用以模拟不同的干旱条件。依据Michel[7]的计算公式，与之相对应的溶液水势梯度大约为0、-0.10、-0.20、-0.40、-0.80 MPa。培养温度为20 ℃/30 ℃。

表1 恒温对种子萌发率、发芽势的影响

项目温度/℃1015202530萌发率/%9.00±1.22aA20.00±2.07aA55.00±2.61bA70.00±3.15cB64.00±3.42cB发芽势/%5.00±0.73aA11.00±1.14aA26.00±2.5bA37.00±2.37cB25.00±2.61bA

注：同行中不同大写字母表示0.01水平差异，不同小写字母表示0.05水平差异。下同。

种子萌发试验在PXZ光照培养箱中进行。每个塑料发芽盒放入25粒种子，每个温度和干旱处理各4个重复。每天12 h/12 h(低温/高温)，12 h/12 h(光照/黑暗)。以胚根与种子本身等长作为种子发芽的标志。每天观察种子萌发情况，并及时清理发霉腐烂的种子。试验周期为15 d。每隔2 d用万分之一天平称重1次，并使用超纯水补充水分。

1.2.3苗期试验设置

试验采用盆栽育苗法。在西藏农牧学院草业科学教学实习基地取大田土壤过筛，并拌入适量腐熟羊粪，放入105 ℃烘干箱内烘3 h，待土壤冷却后装入塑料花盆中(20 cm×15 cm×25 cm)。盆底铺垫双层滤纸，每盆放入过筛的大田土3 kg并播种150粒种子。育苗阶段在光照培养箱中进行，培养条件同干旱试验设置，共种9盆。当垂穗披碱草种子萌发率达到75%时，从人工气候箱中移出，放置自然光照下培养。在垂穗披碱草2叶龄时对其进行间苗，保证每盆100株幼苗；在垂穗披碱草幼苗5叶龄时开始进行干旱胁迫。试验前1 d对每盆材料进行浇水处理，并以正常浇水1 d后的垂穗披碱草作为干旱胁迫对照(ck)。之后，每干旱胁迫7 d取样1次，干旱胁迫21 d，共取3次。试验取样时间为09：00～10：00时，取相同叶位。

1.3 测定指标

1.3.1种子萌发相关指标的测定

萌发率(%)=(最终正常发芽种子数/供试种子总数)×100%；

发芽势(%)=(第5天正常发芽种子数/供试种子总数)×100%；

萌发指数=∑(Gt/Dt)，式中：Gt指t日萌发数，Dt指相应的天数[8]；

活力指数=萌发指数×平均根长[9]。

胚根和胚芽长的测定：从每个处理的塑料发芽盒内随机选取15株正常生长的幼苗，用直尺进行胚根和胚芽长的测量，不够15株的全部都测，取平均值[10]。每个萌发指标3次重复，取平均值。

1.3.2幼苗叶片生理指标的测定

生理指标的测定参照高俊凤[11]和张志良[12]的方法。

叶绿素含量测定采用丙酮浸提法；相对电导率测定采用电导仪法；丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸法；超氧化物歧化酶活性测定采用NBT还原法；过氧化物酶活性测定采用愈创木酚比色法；过氧化氢酶活性测定采用紫外吸收法；脯氨酸含量测定采用酸性茚三酮染色法。每个生理指标重复3次，取平均值。

1.4 耐旱性综合评价

利用隶属函数法对西藏野生垂穗披碱草耐旱性进行综合评价。隶属函数公式：U(Xi) =(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin) ；当性状指标与抗逆性为负相关时用公式：U(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)计算。其中，U(Xi)为隶属函数值；Xi为处理水平某指标测定值；Xmin和Xmax为相应处理水平某一指标的最小值和最大值。用隶属函数公式分别计算垂穗披碱草各项指标的具体隶属函数值[13]。然后把材料各项指标隶属函数值累加求平均值，即得到该材料的隶属度[14]。垂穗披碱草抗旱性强弱参照隶属度的四级制划分标准[7]。

1.5 数据处理与分析

采用DPS 6.0统计分析软件对所测数据进行单因素方差分析，样本间的差异显著性用Tukey’HSD检验，图表用WPS软件制作。

2 结果与分析

2.1 温度对西藏野生垂穗披碱草种子萌发的影响

2.1.1恒温对种子萌发的影响

由表1可知，温度对垂穗披碱草种子萌发率具有极显著影响(p<0.01)。整体上，垂穗披碱草种子萌发率随着温度的上升表现为先升后降的趋势。25 ℃处理下，垂穗披碱草种子萌发率最高，在10 ℃处理下其种子萌发率最低。

与萌发率变化趋势相似，垂穗披碱草种子发芽势整体上随温度的升高而呈先升后降的趋势(表1)。垂穗披碱草种子发芽势在10 ℃处理下最低，在25 ℃处理下最高。15 ℃处理下，垂穗披碱草种子发芽势较对照差异不显著；20 ℃处理下，垂穗披碱草发芽势较对照差异显著(p<0.05)；25 ℃处理下，垂穗披碱草种子发芽势较对照差异极显著(p<0.01)。

表2 变温对种子萌发率、发芽势的影响

项目温度/℃10/2015/2520/3025/35萌发率/%35.00±2.17aA65.00±4.05bA82.00±4.84cB60.00±3.36bA发芽势/%19.00±2.43aA29.00±2.31aA49.00±3.67cB35.00±1.65bA

表3 干旱胁迫对种子萌发的影响

项目聚乙二醇PEG渗透势/MPa0-0.10-0.20-0.40-0.80萌发率/%82.00±3.67aA66.00±5.84aA35.00±4.63bA16.00±4.76cB9.00±2.76cB萌发指数33.50±3.75aA25.75±1.56aA13.75±3.45bB7.75±1.69bB4.25±1.22bB活力指数160.80±11.65aA115.62±10.33aA57.48±9.02bA28.83±6.33cB9.86±1.90cB

2.1.2变温对种子萌发的影响

变温对垂穗披碱草种子萌发率、发芽势具有极显著的影响(p<0.01)(表2)。以20/30℃为界，垂穗披碱草种子萌发率和发芽势随着温度的升高表现为先升后降的趋势。20/30℃处理下，垂穗披碱草种子萌发率、发芽势均达到了最高水平。

由表2可知，20 ℃/30 ℃处理下，垂穗披碱草种子萌发率水平最高。其中，15 ℃/25 ℃处理下垂穗披碱草较对照差异显著(p<0.05)；在20 ℃/30 ℃处理下，垂穗披碱草较对照存在极显著差异(p<0.01)。20 ℃/30 ℃处理下，垂穗披碱草发芽势最高。15 ℃/25 ℃处理下，与对照相比，种子发芽势差异不显著；20 ℃/30 ℃处理下，垂穗披碱草发芽势较对照差异极显著(p<0.01)。

2.2 干旱胁迫对西藏野生垂穗披碱草种子萌发的影响

PEG渗透胁迫对垂穗披碱草种子萌发具有极显著影响(p<0.01)(表3)。研究显示，随着PEG溶液浓度的升高，种子萌发率、萌发指数和活力指数呈下降趋势。-0.20 MPa渗透势下，种子萌发率、萌发指数和活力指数较对照下降显著(p<0.05)。-0.80 MPa渗透势下，垂穗披碱草种子萌发率、萌发指数和活力指数均达到最低水平。

表4 垂穗披碱草种子萌发期抗旱指标隶属函数值及隶属度

萌发率萌发指数活力指数胚根长胚芽长隶属度0.430.450.440.640.580.51

随着PEG溶液浓度的升高，垂穗披碱草胚根和胚芽长呈下降趋势(图1)。系列PEG渗透势处理下，种子胚根和胚芽长均无显著下降。其中，垂穗披碱草胚根和胚芽长在-0.80 MPa渗透势下最低，在对照培养条件下最高。

图1 干旱胁迫对西藏垂穗披碱草根长和芽长的影响

采用隶属函数法对西藏野生垂穗披碱草种子萌发率、萌发指数、活力指数、胚根长和胚芽长等指标进行了综合评价，得出其隶属度依次为0.43，0.45，0.44，0.64，0.58(表4)。垂穗披碱草种子萌发期抗旱隶属度为0.51，在0.4～0.6之间。

2.3 干旱胁迫对西藏野生垂穗披碱草幼苗叶片生理指标的影响

由表5可知，西藏垂穗披碱草幼苗叶片叶绿素a和叶绿素b含量随着干旱胁迫天数的延长而持续下降。干旱胁迫到第14天时，与对照相比，幼苗叶片叶绿素a含量下降显著(p<0.05)。当干旱胁迫到第21天时，幼苗叶片叶绿素b含量较对照下降显著(p<0.05)，且叶片叶绿素a和叶绿素b含量均降到了最低水平。

西藏垂穗披碱草幼苗叶片相对电导率随着干旱胁迫天数的延长而呈不断上升的趋势(表5)。干旱胁迫第7天时，幼苗叶片相对电导率较对照上升显著(p<0.05)。干旱胁迫至第14天时，幼苗叶片相对电导率较对照差异极显著(p<0.01)。

干旱胁迫天数对西藏垂穗披碱草幼苗叶片丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)含量具有极显著的影响(p<0.01)(表5)。随着干旱胁迫天数的增加，MDA、Pro含量呈先升后降的趋势。当干旱胁迫至第14天时，幼苗叶片MDA和Pro含量达到最高水平。干旱胁迫到第21天，叶片MDA和Pro含量出现了小幅度的下降。

表5 干旱胁迫天数对西藏垂穗披碱草幼苗叶片生理指标的影响

项 目 干旱胁迫天数/d071421叶绿素a/(mg·L-1)11.42±1.22aA9.96±1.31aA5.32±0.62bA2.06±0.35bA叶绿素b/(mg·L-1)8.95±1.10aA6.23±1.06aA3.16±0.92aA1.21±0.27bA丙二醛/(mmol·g-1)5.53±1.72aA27.18±3.21bA36.96±5.07cB33.42±5.16cB超氧化物歧化酶/[U·(g·min)-1]22.64±6.36aA39.91±7.09aA62.74±7.89bA57.65±6.44bA过氧化物酶/[U·(g·min)-1]129.00±10.38aA210.33±16.24bA293.80±15.63bA277.80±15.25bA过氧化氢酶/[U·(g·min)-1]10.42±1.35aA20.14±3.86bA26.41±5.93bA23.71±4.82bA脯氨酸/(μg·g-1)9.8±3.54aA23.70±7.20bA68.50±6.76cB65.90±8.42cB相对电导率/(μS·cm-1)10.83±3.14aA25.10±5.33bA48.40±5.87cB51.30±4.69cB

表6 西藏垂穗披碱草苗期抗旱指标隶属函数值及隶属度

叶绿素a叶绿素bMDASODCATPODPro相对电导率隶属度0.4590.5690.6470.5750.5980.6100.5500.5700.553

与MDA和Pro变化趋势相似，西藏垂穗披碱草幼苗叶片超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性均随干旱胁迫天数的增加而呈先升后降的趋势(表5)。其中，叶片SOD、POD、CAT活性分别在干旱胁迫至第14天、14天和第7天时，较对照出现了显著的升高(p<0.05)。通过多项式回归分析得出：干旱胁迫天数与垂穗披碱草幼苗叶片SOD活性的关系为：y=-5.59x2+40.74x-14.18(R2=0.94)；干旱胁迫天数与垂穗披碱草幼苗叶片POD活性的关系为：y=-24.33x2+174.65x-26.40(R2=0.97)；干旱胁迫天数与西藏垂穗披碱草幼苗叶片CAT活性的关系为：y=-3.15x2+20.39x-7.25(R2=0.99)。采用隶属函数法对西藏野生垂穗披碱草叶绿素a、叶绿素b、MDA、SOD、POD、CAT、脯氨酸、相对电导率等指标进行了综合评价，得出其隶属度依次为0.459，0.569，0.647，0.575，0.598，0.610，0.550，0.570(表6)。西藏垂穗披碱草幼苗期抗旱隶属度为0.553，在0.4～0.6之间。

3 结果讨论

3.1 温度对西藏野生垂穗披碱草种子萌发的影响

研究表明，低温是限制种子萌发并形成幼苗的关键因子[15-16]。本试验也证实了这一点，西藏垂穗披碱草在恒温10 ℃和变温10 ℃/20 ℃培养条件下其萌发率和发芽势最低，分别为9.00%、35.00%和5.00%、19.00%，可能是低温抑制了种子内部的酶活性，进而影响了种子的萌发[17]。恒温25 ℃和变温20 ℃/30 ℃处理下，西藏垂穗披碱草种子萌发率和发芽势最高，分别为71.00%、82.00%和37.00%、49.00%，可能是该温度提高了酶的活性，促进了种子萌发。这与王传旗等[18]关于西藏浪卡子县野生垂穗披碱草种子萌发对水盐胁迫的响应研究结果相类似。此外，西藏垂穗披碱草种子萌发率、发芽势在变温20 ℃/30 ℃处理下比恒温25 ℃处理下分别提高了11.00%和12.00%。说明变温更有利于西藏垂穗披碱草种子萌发。这与葛庆征等[19]关于温度对垂穗披碱草种子萌发的影响结果相似。

3.2 干旱胁迫对西藏野生垂穗披碱草种子萌发生理的影响

聚乙二醇(PEG-6000)是一种较理想的高分子渗透剂，可以最大限度的减少天气、土壤和蒸腾等环境因素的影响[20]。本研究对西藏野生垂穗披碱草种子萌发率、萌发指数、活力指数及胚根和胚芽长度等5项指标进行综合抗旱性分析表明，种子萌发率、萌发指数、活力指数及胚根、胚芽长等随着PEG-6000溶液浓度的升高而呈下降趋势。0～-0.10 MPa渗透势下，西藏垂穗披碱草种子萌发率在65%以上；当PEG渗透势为-0.20 MPa时，种子萌发率则显著下降(p<0.05)；当PEG渗透势为-0.80 MPa时，西藏垂穗披碱草萌发率不足10%，较对照差异极显著(p<0.01)。垂穗披碱草胚根和胚芽长在-0.80 MPa的渗透势下较对照下降显著(p<0.05)。干旱胁迫抑制了西藏野生垂穗披碱草种子萌发。这一特性与王传旗等[21]对赖草种子的水温胁迫研究结论基本一致。

3.3 干旱胁迫对西藏野生垂穗披碱草幼苗叶片生理的影响

干旱胁迫会造成叶绿体的变形和片层结构的破坏，使叶绿素含量减少[22]，本研究显示，西藏垂穗披碱草幼苗叶片叶绿素a和叶绿素b含量随着干旱胁迫天数的增加而下降，这与祁娟等[23]报道一致。MDA含量是鉴别植物细胞膜破坏程度的重要指标之一。张小娇等[24]研究表明，随着干旱胁迫天数的延长垂穗披碱草MDA含量呈上升趋势。本试验也证实了这一点，西藏垂穗披碱草幼苗叶片MDA含量随着干旱胁迫天数的增加而升高，当干旱胁迫至第21天时则出现了下降的现象，可能是植物叶片枯萎所致。研究显示，随着干旱胁迫天数的增加垂穗披碱草幼苗叶片SOD、POD和CAT活性出现了不同程度的上升趋势，在干旱胁迫至第14天时，SOD、POD、CAT活性明显均达到峰值。说明这3种酶在清除自由基时形成互补，可以使垂穗披碱草在干旱逆境下免受伤害。西藏垂穗披碱草幼苗叶片脯氨酸含量随着干旱胁迫天数的延续而增加。当连续干旱胁迫至第7天时，叶片脯氨酸的含量显著增加(p<0.05)。这与祁娟等[25]对披碱草与老芒麦苗期抗旱性综合评价结论相类似。当干旱胁迫至第21天时幼苗叶片脯氨酸出现了小幅度的下降现象。可能是水分胁迫到一定程度时，脯氨酸的积累就会慢慢减少或消失。西藏垂穗披碱草幼苗叶片相对电导率随着干旱胁迫天数的增加而呈不断上升的趋势。可能是干旱胁迫破坏了细胞膜的完整性，使细胞内的一些可溶性物质外渗[26]。这与靳军英等[27]3种牧草对干旱胁迫的生理响应及抗旱性评价研究结果相一致。

西藏野生垂穗披碱草适宜萌发温度为恒温25 ℃、30 ℃和变温15 ℃/25 ℃、20 ℃/30 ℃，种子萌发率可达60%以上。垂穗披碱草种子萌发期和苗期抗旱隶属度均在0.4～0.6之间，属于Ⅱ级较抗。因此，西藏野生垂穗披碱草在西藏干旱和半干旱地区建植人工或半人工栽培草地具有较大的应用潜力，可作为西藏乡土禾草抗旱性育种的重要种质资源开发利用。