西藏3份垂穗披碱草耐旱性评价

周 晶 孙 侃 周忠义 王传旗 苗彦军

（1深圳市北林苑景观及建筑规划设计院有限公司，518038，广东深圳；2牙克石市草原工作站，022150，内蒙古牙克石；3西藏农牧学院，860000，西藏林芝）

西藏是我国西南边陲重要的生态屏障，为披碱草属（Elymus）牧草主要分布区之一。青藏高原自然环境严酷，寒冷干燥的气候条件对牧草的生存、产量和品质都有很大影响[1]。藏北地区草畜矛盾突出，草地退化严重，而干旱是制约藏北高寒草原植被修复和人工草地建植的关键因素。因此，亟需培育出耐旱性强的乡土植物品种。

垂穗披碱草（E.nutans）为禾本科披碱草属多年生牧草和生态草，是西藏乡土禾草植物中的优势草种之一，对西藏高寒地区人工草地建植和天然草地植被修复具有重要意义。在旱区和缺水区，水分是影响植物生长发育的重要生态因子。植物对干旱胁迫的响应主要表现在外部形态和内部生理代谢方面。例如，植物通过减缓生长速率[2]、将更多的生物量分配到根部[3]、降低株高[4]、减少叶面积[5]、提高渗透调节物质含量[6]和抗氧化酶活性[7]等方式应对干旱胁迫环境。目前，关于垂穗披碱草耐旱性的研究主要集中于萌发期或幼苗期阶段。马青枝等[8]研究表明，聚乙二醇（PEG-6000）溶液对披碱草（E.dahuricus）萌发率、发芽势和发芽指数等具有抑制作用，且其开始发芽天数和发芽高峰期均被推迟。但也有不同研究结果，余芳玲等[9]研究发现，50g/L PEG-6000处理有利于垂穗披碱草种子萌发。在垂穗披碱草苗期耐旱性研究中，张小娇等[10]研究认为，干旱胁迫影响垂穗披碱草光合作用以及物质代谢，主要表现为叶绿素含量降低，脯氨酸、丙二醛和可溶性糖含量增加。干旱胁迫也影响垂穗披碱草的抗氧化清除系统。王传旗等[11]研究表明，干旱胁迫14d后，垂穗披碱草叶片脯氨酸含量和过氧化氢酶活性下降。在垂穗披碱草耐旱性研究中，多是针对垂穗披碱草单个生育期进行单项机理研究。然而，干旱对植物的影响不仅是巨大的，而且表现在不同生长阶段。因此，本文从垂穗披碱草萌发期和幼苗期2个阶段入手，选取西藏那曲市班戈县和索县2个地区的2份野生垂穗披碱草为研究材料，同时以巴青垂穗披碱草为对照材料，探讨垂穗披碱草在萌发期和幼苗期对干旱胁迫的生理响应，为选育耐旱性强的垂穗披碱草新品种提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与区域概况

野生垂穗披碱草种子于2016年9月采自西藏那曲市班戈县和索县。班戈县属高原亚寒带半干旱季风气候区，寒冷干燥，无绝对无霜期；年均气温0℃左右，年均日照2850h，年降水量289～390mm，年均蒸发量1993.40～2104.10mm。索县属高原亚寒带季风气候，冬春季多大风，年无霜期仅40d左右；年均气温-2℃，年均日照 2477.20h，年降水量572.90mm，年均蒸发量1460～1550mm[12]。采集的种子风干后于4℃保存。巴青垂穗披碱草（驯化品种）作为对照材料。材料来源见表1。

表1 材料与来源Table 1 Materials and source status

1.2 试验方法

1.2.1 萌发期试验 随机选取垂穗披碱草种子各600粒，放入70%乙醇溶液中浸泡2min，用超纯水冲洗备用[13]。配制水势为 0.00、-0.10、-0.20、-0.40、-0.80和-1.00MPa的PEG-6000溶液[14]。采用纸上发芽法，培养皿中铺双层无菌滤纸，加5mL对应的PEG-6000溶液。每个培养皿中排25粒种子。每个处理4次重复。种子萌发试验在PXZ智能光照培养箱中进行，发芽条件为30℃/20℃（昼温/夜温），光周期12h，光照强度4000lx。以芽长达到种子长度的 1/2作为种子发芽的判定标准[15]。试验周期15d，为保证处理组的渗透势不变，每隔2d称重1次，用超纯水补充蒸发的水分。

1.2.2 幼苗期试验 在西藏农牧学院教学实习基地取土，拌入适量腐熟羊粪，于105℃烘箱中烘3h。将土壤（约3kg）装入花盆中（20cm×15cm×25cm），播种100粒。3叶龄时开始间苗，保证每盆有50株幼苗；待苗龄为5叶期时进行干旱胁迫。采用停水处理的方法模拟干旱胁迫环境，并于试验前 1d对每盆材料进行充分供水（作为对照组），干旱胁迫后每7d取样一次，共取样3次，每个处理3次重复。取样部位为垂穗披碱草主茎向上第4片叶。

1.3 测定指标与方法

萌发率（germination percentage，GP）=（第15天发芽种子数/100）×100%；发芽指数（germination index，GI）=∑（Gt/Dt），Gt指第 t天的种子发芽数，Dt指相对应的发芽天数[16]；活力指数（vigor index，VI）=发芽指数×Sx，Sx 为平均根长[17]；根芽长（root and bud length，cm）：从每个处理随机取15株幼苗进行测量，取平均值。

采用电导法测定相对电导率（relative conductivity，REC）[18]；采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量[18]；采用NBT还原法测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性[19]；采用愈创木酚比色法测定过氧化物酶（peroxidase，POD）活性[19]；采用紫外吸收法测定过氧化氢酶（catalase，CAT）活性[19]。

1.4 耐旱性综合评价

隶属函数公式：U(Xi)＝(Xi–Xmin)/(Xmax–Xmin)。其中，U(Xi)为隶属函数值；Xi为某指标的测定值；Xmin和Xmax为某指标的最小值和最大值。

隶属度：依据隶属函数公式求得垂穗披碱草相关指标在干旱处理下的具体隶属函数值，然后将每份材料抗旱性指标的隶属函数值累加求平均值[20]。隶属度划分标准[21]：0.6～0.7为强抗，定为Ⅰ级；0.4～0.6为较抗，定为Ⅱ级；0.3～0.4为弱抗，定为Ⅲ级；隶属度＜0.3为不抗或易感，定为Ⅳ级。

1.5 数据分析

使用SPSS 19.0软件进行数据分析，用Tukey’HSD检验样本间的显著性，用回归分析来确定相关指标与干旱胁迫时间的关系。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫下垂穗披碱草种子萌发特性

由表2可知，随着渗透势的降低，巴青垂穗披碱草的GP、GI和VI呈先升后降趋势，而Ⅰ号和Ⅱ号的GP、GI和VI呈下降趋势。-0.10MPa处理下，巴青垂穗披碱草种子 GP、GI和 VI均高于0.00MPa处理，但差异不显著。-0.20MPa处理下，Ⅰ号和Ⅱ号的 VI较 0.00MPa处理显著下降（P＜0.05）。-0.40MPa处理下，与0.00MPa处理相比，巴青垂穗披碱草的GI和VI显著下降（P＜0.05）；Ⅰ号和Ⅱ号的GP和GI下降显著（P＜0.05），VI极显著下降（P＜0.01）。-0.80MPa处理下，与0.00MPa处理相比，巴青垂穗披碱草 GP显著下降（P＜0.05），VI极显著下降（P＜0.01）。

表2 干旱胁迫对垂穗披碱草种子萌发的影响Table 2 Effects of drought stress on seed germination of E.nutans

由表3可知，随着渗透势的降低，巴青垂穗披碱草根芽比呈上升趋势，Ⅰ号和Ⅱ号根长、芽长呈下降趋势。与0.00MPa处理相比，-0.10MPa处理下，巴青垂穗披碱草根长增加，但差异不显著，之后随着渗透势降低而下降。-0.40MPa处理下，Ⅰ号和Ⅱ号芽长较 0.00MPa显著下降（P＜0.05）。-0.80MPa处理下，巴青垂穗披碱草芽长较0.00MPa显著下降（P＜0.05）。-1.00MPa处理下，Ⅰ号和Ⅱ号根长较0.00MPa显著下降（P＜0.05），幼苗根芽比显著上升（P＜0.05）。

表3 干旱胁迫对垂穗披碱草幼苗生长的影响Table 3 Effects of drought stress on growing of E.nutans seedlings

采用隶属函数法对Ⅰ号、Ⅱ号和巴青垂穗披碱草萌发期相关指标进行综合评价，其隶属度依次为0.522、0.495 和 0.554（表 4）。

表4 干旱胁迫下垂穗披碱草种子萌发期属函数值及隶属度Table 4 Subordinate function value and subordinate degree of E.nutans under drought stress at germination stage

2.2 干旱胁迫下垂穗披碱草幼苗生理特征

逆境胁迫下，REC和MDA含量是鉴定植物细胞膜损伤程度的重要指标。随着干旱胁迫天数的增加，幼苗叶片REC和MDA含量呈上升趋势（表5）。与0d相比，干旱胁迫第7天，Ⅰ号叶片MDA含量显著上升（P＜0.05），REC极显著上升（P＜0.01）；Ⅱ号叶片REC显著上升（P＜0.05），MDA含量极显著上升（P＜0.01）；巴青垂穗披碱草叶片REC和MDA含量显著上升（P＜0.05）。与0d相比，干旱胁迫第14天，Ⅰ号叶片MDA含量极显著上升（P＜0.01），Ⅱ号叶片REC极显著上升（P＜0.01），巴青垂穗披碱草叶片REC和MDA含量极显著上升（P＜0.01）。通过线性回归方程分析，干旱胁迫天数与Ⅰ号、Ⅱ号和巴青垂穗披碱草叶片MDA 含量关系分别为y=11.59x–5.20（R2=0.89）、y=12.18x–0.74（R2=0.86）和y=10.60x–6.07（R2=0.94）；干旱胁迫天数与Ⅰ号、Ⅱ号和巴青垂穗披碱草叶片 REC的关系分别为y=12.88x+1.98（R2=0.90），y=16.79x–2.85（R2=0.99）和y=14.17x–8.15（R2=0.99）。

表5 干旱胁迫对幼苗细胞膜损伤程度的影响Table 5 Effects of drought stress on cell membrane damage degree of seedlings

幼苗叶片SOD、POD和CAT活性均随干旱胁迫天数的增加而升高，并分别在干旱第21天出现了小幅度下降现象（表6）。与0d相比，干旱胁迫第7天，3个材料叶片SOD、POD和CAT活性显著上升（P＜0.05）；干旱胁迫第14天，叶片SOD活性极显著上升（P＜0.01）。通过多项式回归方程分析，干旱胁迫天数与Ⅰ号、Ⅱ号和巴青垂穗披碱草叶片 SOD活性关系分别为y=-6.87x2+50.11x–18.37（R2=0.88）、y=-4.38x2+36.21x–15.47（R2=0.92）和y=-4.63x2+40.9x–3.87（R2=0.88）；干旱胁迫天数与Ⅰ号、Ⅱ号和巴青垂穗披碱草叶片POD活性关系分别为y=-22.81x2+164.17x–31.97（R2=0.95）、y=-4.38x2+36.21x–15.47（R2=0.92）和y=-13.03x2+96.58x+99.17（R2=0.96）；干旱胁迫天数与Ⅰ号、Ⅱ号和巴青垂穗披碱草叶片 CAT活性关系分别为 y=-3.36x2+22.74x–9.22（R2=0.99）、y=-24.45x2+163.32x–25.98（R2=0.97）和y=-2.42x2+21.4x–2.17（R2=0.92）。

表6 干旱胁迫下幼苗叶片抗氧化酶活性变化Table 6 Changes of antioxidant enzyme activities in seedling leaves under drought stress

采用隶属函数法对Ⅰ号、Ⅱ号和巴青垂穗披碱草幼苗期相关生理指标进行了综合评价，其隶属度依次为0.591、0.580和0.598（表7）。

表7 垂穗披碱草幼苗期隶属函数值及隶属度Table 7 Subordinate function value and subordinate degree of E.nutans at seedling stage

3 讨论

3.1 种子萌发对干旱胁迫的生理响应

本研究中，-0.10MPa处理下，巴青垂穗披碱草种子GP、GI和VI均高于0.00MPa处理，说明低浓度的PEG-6000溶液有利于巴青垂穗披碱草种子萌发。其原因可能是低渗透势引发了种子内部相关酶的活性，从而提高了种子萌发率[22]。这与王传旗等[23]研究结果一致。王传旗等[24]研究表明，高浓度的PEG-6000溶液渗透势抑制了垂穗披碱草种子萌发，本研究也证实了这一点，-0.20MPa及以下水分亏缺条件下，巴青垂穗披碱草种子萌发受到了抑制。本研究中，PEG-6000抑制了Ⅰ号和Ⅱ号种子萌发，主要表现为随着PEG-6000渗透势的降低，GP、GI和VI呈下降趋势。

在干旱或缺水区，水分是限制植物生长的主要生态因子，为适应干旱胁迫环境，植物会调整器官的生长[25]。巴青垂穗披碱草芽长随着PEG-6000渗透势的降低而持续下降，但其根长在-0.10MPa处理下高于0.00MPa。表明低浓度PEG-6000溶液处理下，巴青垂穗披碱草将更多的生物量分配到根部，以促使其向地下更深处生长，这是垂穗披碱草适应干旱环境的重要方式，同时对其在西藏半干旱地区的生存延续具有重要的生物学意义。此结果与王传旗等[26]在西藏野生老芒麦种子萌发对温度和水分的响应中的研究结果相类似。此外，本研究中，PEG-6000渗透胁迫对垂穗披碱草幼苗地上部分生长的抑制作用大于地下部分。这与汪建军等[27]研究结果类似。

3.2 幼苗对干旱胁迫的生理响应

随着干旱胁迫天数的增加，幼苗叶片 REC不断升高，原因可能是细胞脱水导致其质膜变形，使细胞内的电解质外渗所致[28]。Sclote等[29]研究表明，植物细胞膜脂过氧化程度会随干旱胁迫时间的延长而增加。本试验也证实了这一结果，随着干旱胁迫天数的增加，幼苗叶片MDA含量呈上升趋势，并在干旱胁迫至第21天时最大。随着干旱胁迫天数的增加，幼苗REC和MDA含量呈上升趋势，表明垂穗披碱草幼苗已经受到了干旱胁迫的伤害。

幼苗叶片SOD、POD和CAT活性随着干旱胁迫天数的增加而升高，并在干旱胁迫至第14天时，均达到了最高水平。这与许令明等[30]对花叶芦竹（Arundodonaxvar.versicolor）和许爱云等[31]对苜蓿（Medicagosativa）的研究结果类似。表明干旱胁迫下，垂穗披碱草启动了体内的抗氧化清除系统，并通过提高保护酶活性来适应不利的干旱胁迫环境，这也是垂穗披碱草适应干旱环境的重要途径之一。当干旱胁迫至21d时，幼苗SOD、POD和CAT活性均出现了小幅度的下降现象。这可能是干旱胁迫天数超过了垂穗披碱草对干旱胁迫的耐受期，使其叶片细胞内的各种代谢出现紊乱所致。

4 结论

适宜巴青垂穗披碱草种子萌发的 PEG-6000渗透势范围为0.00～-0.10MPa。干旱胁迫第14天为Ⅰ号、Ⅱ号和巴青垂穗披碱草幼苗耐旱的转折点，第21天为其耐旱的极限。供试的3份垂穗披碱草萌发期和幼苗期隶属度均介于0.4～0.6，属于Ⅱ级（较抗）。综上，Ⅰ号、Ⅱ号和巴青垂穗披碱草可作为西藏乡土禾草植物抗旱性育种的重要种质材料，但鉴于植物抗旱性的复杂性和提高西藏旱区牧草生产的紧迫性，应积极组织对其进行长期系统的综合研究。