ALA对高温胁迫下苜蓿属3个品种叶片生理的影响

张 鹤，敖平星，赵 雁

(云南农业大学园林园艺学院，云南 昆明650201)

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是植物体内所有四吡咯化合物(如血红素、叶绿素、维生素B12和卟啉等)生物合成的关键前体，与植物的生命活动密切相关[1-2]。研究表明ALA是一种新型植物生长调节剂，能调节植物生长发育[3]，提高叶绿素含量[4]，显著促进光合速率[5-6]。如外源ALA处理可以上调马铃薯(Solanumtuberosum)叶片PSⅡ反应中心核心蛋白D1和D2编码基因表达，提高光系统Ⅱ(Photosystem Ⅱ，PSⅡ)反应中心活性，促进光合运转速率[7]；Wang等[8]对小麦(Triticumaestivum)的研究也发现了相似的结论。此外，喷施ALA还可以调节逆境胁迫下植物体内的抗氧化酶活性，清除过剩的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，降低相对电导率(Relative conductivity，EL)和丙二醛(Malonydialdehyde，MDA)含量，保护细胞膜稳定性，从而提高植物抗逆性[9]。ALA对人类和牲畜没有毒害作用，可生物降解、对环境友好[10]，因此在植物抗逆性研究中具有巨大的潜力。目前，利用外源ALA提高植物抗逆性的研究主要集中在无花果(Ficuscarica)[11]、黄瓜(Cucumissativus)[12]、西瓜(Vitisvinifera)[13]等园艺作物上，而对其影响豆科牧草抗逆性的研究鲜有报道。

近几年全球气候骤变，高温气候环境越来越严重。根据IPCC第六次报告公布的数据，预计到2100年气温将上升1.5～5.8℃[14]。高温引起植物形态结构、生理、生化和分子水平的一系列变化，最终影响植物的生长发育，导致经济产量和品质严重下降[15-16]。在高温胁迫下，氧化应激通常产生大量的ROS，过剩的ROS可以通过叶绿体、线粒体和过氧化物酶体的氧化对植物细胞造成不可逆的损伤[17]。开发抗高温胁迫的品种或喷施植物生长调节剂提高植物耐热性是研究热点[18-19]。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)和南苜蓿(MedicagohispidaL.)均为苜蓿属优质牧草，但高温胁迫是限制其在亚热带地区大面积推广应用的主要因素之一。鉴于此，本研究以苜蓿属3个品种为材料，探究外源ALA延缓高温胁迫下苜蓿植物叶片衰老的生理机制，为ALA在苜蓿植物上的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试品种为紫花苜蓿(M.sativa)WL525HQ购于北京正道生态科技有限公司，德钦苜蓿(M.sativa‘Deqin’)由云南农业大学毕玉芬教授赠送，楚雄南苜蓿(M.hispida‘Chuxiong’)由云南省草地动物研究所赠送，3个品种的种子均为当年生种子，均存于4℃避光条件下，种子发芽率分别为92%，68%，76%。

1.2 试验处理

将颗粒饱满的苜蓿种子置于湿润的纱布中，25℃催芽，然后移栽至小花盆中，栽培基质为灭菌泥炭土，每盆栽植4株(7 cm×7 cm)。每隔2 d浇1次Hoagland营养液，并将小花盆放置于光照培养箱内进行培养，培养温度为24℃/18℃(昼/夜)，白天12 h，夜晚12 h，相对湿度在65%，光照强度为400 μmol·m-2·s-1。待长至35 d苗龄时，选取长势一致的苜蓿植株放入人工智能气候箱中模拟高温环境胁迫。在进行高温胁迫前先对苜蓿植株进行ALA预处理，即在常温下(24℃/18℃昼/夜12 h/12 h)对植株叶面喷施不同浓度的ALA水溶液(0，5，10，15，20，25 mg·L-1ALA)，以叶片正面和背面湿润滴水为标准，连续喷施4 d，再进行高温胁迫(42℃/38℃，昼/夜，12 h/12 h) 3 d。试验共设置7个处理：①常温培养+蒸馏水(CK)；②高温胁迫+蒸馏水(Heat)；③高温胁迫+5 mg·L-1ALA (HA1)；④高温胁迫+10 mg·L-1ALA (HA2)；⑤高温胁迫+15 mg·L-1ALA (HA3)；⑥高温胁迫+20 mg·L-1ALA (HA4)；⑦高温胁迫+25 mg·L-1ALA (HA5)。每个处理重复3次，高温胁迫3 d后采集苜蓿植株顶芽下第一片真叶，-80℃保存，用于各生理指标的检测。

1.3 生理指标的测定

叶绿素含量采用酒精浸提法测定[20]；MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定[21]；相对电导率的测定方法参照叶尚红等[22]的方法并稍作改动；SOD、POD和CAT活性参考李合生[21]的方法并加以改良。

1.4 隶属函数值及隶属度[23]

隶属函数值计算公式：

X(u)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

X(u)=1-[(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)]

(2)

式中：X为各苜蓿属植物中某一指标的测定值，Xmin为该指标测定值的最小值，Xmax为该指标测定值的最大值；当测定指标与植物耐热性呈正相关时采用公式(1)，当测定指标与植物耐热性呈负相关时采用公式(2)。

隶属度=∑(X(u1)+X(u2)+…+X(un)/n

式中：n为指标数量。

1.5 统计分析

用Excel计算和整理数据；用SPSS 21.0对不同处理的各指标进行方差分析(P<0.05)，用LSD和Dunnett T3对各参数平均数进行显著性检验和多重比较，同时，以处理和品种作为固定因子，对各指标进行双因素方差分析；用Origin 2019做图。

2 结果与分析

2.1 ALA对高温胁迫下苜蓿属植物叶片相对电导率和MDA含量的影响

外源ALA浓度梯度对高温胁迫下3个苜蓿品种叶片的影响表现出浓度效应(图1)。与CK相比，Heat处理使各品种中叶片发生了枯萎失绿现象，而经不同浓度ALA预处理后再进行高温胁迫，各品种中叶片枯萎失绿程度降低。这种形态上的变化趋势在生理指标EL和MDA含量中也得到验证。由图2可知，Heat处理使各品种中叶的EL和MDA含量显著升高(P<0.05)。与CK相比Heat处理下各品种苜蓿叶中EL分别升高了205.844%，206.589%和226.741% (图2A)，MDA含量分别升高了112.649%，110.140%和124.664% (图2B)。高温胁迫下喷施不同浓度ALA预处理后，各品种中叶的EL和MDA含量与Heat处理相比均显著降低(P<0.05)，其中在HA4处理下各品种中叶的EL和MDA含量最低，与CK差异不显著，且各品种中叶的EL和MDA在HA2、HA3和H5处理间两两差异不显著。

图1 不同处理下的苜蓿植株叶片形态Fig.1 The morphology of alfalfa plants leaves under different treatments注：A,楚雄南苜蓿(M. hispida ‘Chuxiong’)，B,紫花苜蓿WL525HQ(M. sativa ‘WL525HQ’)，C,德钦紫花苜蓿(M. sativa ‘Deqin’)Note:A,M. hispida ‘Chuxiong’,B, M. sativa ‘WL525HQ’,C,M. sativa ‘Deqin’

图2 ALA对高温胁迫下苜蓿叶片相对电导率和MDA含量的影响Fig.2 Effect of ALA on EL and MDA content of Medicago leaves under high temperature stress注：同品种不同处理下，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；M-525代表紫花苜蓿WL525HQ(M. sativa ‘WL525HQ’)，M-DQ代表德钦紫花苜蓿(M. sativa ‘Deqin’)，M-CX代表楚雄南苜蓿(M. hispida ‘Chuxiong’)。下同Note:Different lowercase letters indicate significant differences between different treatment of the same cultivar at the 0.05 level. M-525 for M. sativa ‘WL525HQ’,M-DQ for M. sativa ‘Deqin’,M-CX for M. hispida ‘Chuxiong’. The same as below

2.2 ALA对高温胁迫下苜蓿属植物叶片抗氧化酶活性的影响

由图3可知，Heat处理使各品种中叶的CAT、SOD和POD活性显著降低(P<0.05)。与CK相比Heat处理下各品种苜蓿叶中CAT活性分别下降了46.510%，45.292%和51.065%(图3A)；SOD活性分别下降了53.176%，52.416%和56.150% (图3B)；POD活性分别下降了28.325%，28.235%和35.448%(图3C)。高温胁迫下喷施不同浓度ALA预处理后，各品种中叶的CAT,SOD和POD活性与Heat处理相比均有上升，且这3个酶活性随着ALA浓度的增加总体上呈现先升后降的趋势；其中在HA4处理下各品种中叶的CAT、SOD和POD活性达到峰值，与Heat差异显著(P<0.05)，与CK差异不显著；且各品种中叶的3个酶活性在其余ALA处理间两两差异不显著，与Heat也无显著差异。

图3 ALA对高温胁迫下苜蓿叶片CAT、SOD和POD活性的影响Fig.3 Effect of ALA on CAT，SOD and POD activity of Medicago leaves under high temperature stress

2.3 ALA对高温胁迫下苜蓿属植物叶片叶绿素含量的影响

由图4可知，Heat处理使各品种中叶绿素a、b和总叶绿素含量均显著降低(P<0.05)。与CK相比Heat处理下3个品种苜蓿叶绿素a分别下降了36.214%，29.890%和48.875% (图4A)；叶绿素b分别下降了47.387%，30.611%和52.147% (图4B)；总叶绿素含量分别下降了39.775%，30.137%，49.903% (图4C)。高温胁迫下喷施不同浓度ALA预处理后，各品种中叶绿素a,b和总叶绿素含量与Heat处理相比均有上升，且这3个指标随着ALA浓度的增加呈现先升后降的趋势。在HA4处理下各品种中叶绿素a,b和总叶绿素含量最大且显著高于Heat处理(P<0.05)，但与其余4组ALA处理和CK相比差异不显著。

图4 ALA对高温胁迫下苜蓿叶片叶绿素含量的影响Fig.4 Effect of ALA on chlorophyll content of Medicago leaves under high temperature stress

2.4 影响苜蓿属植物各测定指标的因素效应分析

利用SPSS 21.0软件中一般线性模型对品种和处理进行双因素方差分析可知(表1)，处理对各测定指标有显著影响(P<0.05)；品种除了对CAT和POD活性无显著影响外，对其余指标均有显著影响(P<0.05)；处理和品种的交互作用对所有指标均无显著影响。由于Partial Eta Squared(η2)值的大小表示着主效应的大小[24]，故在上述的显著效应中，其对各测定指标作用的大小次序为：处理>品种。因此在本试验分析中主要考虑不同处理对苜蓿植株各测定指标的影响，虽然品种间也存在显著差异，但这种差异可能是由品种自身特异性所决定的，所以未考虑品种间的差异。

表1 品种和处理对各测定指标的双因素方差分析Table 1 Two way ANOVA of variety and treatment on each measured index

2.5 ALA缓解苜蓿属植物高温胁迫适宜浓度的筛选

隶属函数分析提供了一种在多指标测定基础上，对植物特性进行综合评价的方法，这种分析方法可以消除单一指标评价的片面性[25]。为了能够清晰的反映不同浓度ALA预处理对苜蓿植物耐热性的影响，采用隶属函数分析将3个苜蓿品种中与耐热性相关的8个指标进行综合评价。由表2可知，在HA4处理下，这8个指标的隶属函数值大多都很高，隶属度为0.969，排名第1，优于CK，说明20 mg·L-1ALA预处理对这3个苜蓿品种高温胁迫的缓解作用最好，耐热性也最强。在高温胁迫下(Heat)，各指标的隶属函数值和隶属度最小均为0.000，处于本次耐热性排序的末端，说明在高温胁迫下未经ALA预处理的各苜蓿品种受到的热损害最严重，耐热性最差。

表2 ALA对高温胁迫下苜蓿叶片各测定指标的隶属函数分析Table 2 Membership function analysis of ALA on various measured indexes of Medicago leaves under high temperature stress

3 讨论

5-氨基乙酰丙酸(ALA)是一种天然氨基酸，具有生长发育调节功能[26]，可以提高植物的抗逆性，在农林生产上具有广阔用途。在园林植物上，用 50 mg·L-1ALA可以提高金森女贞(Ligustrumjaponicum‘Howardii’)叶片的耐热性[27]；在园艺作物上，用25 mg·L-1ALA能促进低温胁迫下番茄(Solanumlycopersicum)幼苗的生长，提高其抗冷性[28]；在大田作物上，用30 mg·L-1ALA可提高RWC和叶绿素含量，增强油菜(Brassicanapus)的抗旱性[29]。尽管不同植物间的反应有所差异，但ALA能明显提高植物的抗逆性。本研究对3个苜蓿品种的各耐热性指标进行双因素方差分析，结果表明，与品种因素相比，ALA处理对苜蓿植株耐热性的影响作用占主导地位，其中以20 mg·L-1ALA能显著提高苜蓿抵抗高温的能力。

高温胁迫下植物体内会积聚大量的活性氧，从而加剧细胞膜脂的过氧化作用，并破坏细胞膜的稳定性，使细胞液外渗，导致相对电导率升高[30-31]。而膜脂过氧化的最终产物之一是MDA[32]。所以常将MDA含量和相对电导率作为评判植物细胞膜受损程度的重要指标[33]。有研究表明，高温下细胞膜系统的稳定性与相关相对电导率和MDA含量呈现负相关[34]。冯汉青等[35]研究表明，在高温胁迫下外源ALA的施用可以显著降低当归幼苗(Angelicasinensis)中MDA含量，增强了幼苗对逆境的适应能力。本研究结果表明，在高温胁迫下3个品种中叶片的相对电导率和MDA含量显著升高，叶片出现枯萎失绿现象，施用不同浓度的ALA预处理后可降低相对电导率和MDA含量，增强细胞膜的稳定性。在高温胁迫下，较高活性的抗氧化酶能够有效除细胞内过剩自由基和活性氧，保护细胞免受氧化伤害，维持植物正常生长[36-38]。与对照相比，在高温胁迫下各苜蓿品种中叶片的中抗氧化酶(SOD，POD和CAT)活性均有显著下降，施用外源ALA预处理后，3种抗氧化酶活性均升高，这与Katuwal等[39]的研究结果相似。在高温胁迫下，ALA通过提升3个苜蓿品种中叶片的膜稳定性和抗氧化能力来延缓叶片衰老，从而提高其耐热性。

光合作用是植物体进行物质转换及能量代谢的主要途径，而叶绿素又是植物进行光合作用的主要色素，其含量的高低很大程度上决定着植物光合能力的强弱[2]。在植物中，ALA是合成叶绿素分子中吡咯环的起始物质，能够调节植物叶绿素的合成，促进叶绿素a氧化为叶绿素b[40]。Zhang等[41]研究表明，盐胁迫下外源ALA处理能使决明(Cassiaobtusifolia)叶片保持较高的叶绿素含量和光合速率，叶自慧等[42]对菊花(Chrysanthemum×morifolium)的研究也发现了相似的结论。本研究结果与之相似，在高温胁迫下施用外源ALA预处后可以提高各品种中叶片的叶绿素a、b和叶绿素总量。

4 结论

高温胁迫抑制了紫花苜蓿WL525HQ和德钦苜蓿以及楚雄南苜蓿叶片的生长，使叶片出现枯萎失绿的现象。经ALA预处理后能有效缓解高温胁迫对这3个苜蓿品种的热损伤，使叶片中相对电导率和MDA含量显著降低，保护膜稳定性；提高抗氧化酶(CAT、SOD和POD)活性，延缓叶片衰老；增加叶绿素含量，促进光合作用，进而提高3个苜蓿品种的耐热性。隶属函数综合评价认为当ALA浓度为20 mg·L-1时缓解高温胁迫效果最好。