DCE-MRI定量参数评估直肠癌分化程度及Ki67表达的应用价值研究

李 玉，张凤翔（通讯作者），张 芳

（1.包头医学院，内蒙古 014000；2.鄂尔多斯市中心医院 影像科，内蒙古 017000）

直肠癌因其高发病率和高死亡率已经成为当今关系公共卫生健康的重要问题。分子细胞学知识的进步以及生物标志物的检测对肿瘤预测、早期诊断和改善预后非常重要［1］，一个可靠的生物学指标对协助临床进行精准治疗大有裨益［2］。Ki67是已知的直肠癌中预测肿瘤行为和预后的可靠指标，Ki67的高表达与直肠癌的侵袭性和预后不良密切相关［3］。然而，有创性的组织免疫学检测难以重复，且活检样本可能因为采样的条件、技术等外在因素的影响而不能全面反映肿瘤表达的异质性。DCE-MRI图像清晰，且定量分析可以评价肿瘤组织的灌注及渗透特性，因此在科研与临床工作中广泛应用［4］。本文旨在探究DCE-MRI定量参数Ktrans值、Kep值和Ve值与直肠癌分化程度及生物学指标Ki67表达高低之间的关系，探究通过无创方式反映肿瘤的病理进展状态，为协助临床诊疗及预后评价提供一定的指导。

1 资料与方法

1.1 临床资料

本研究收集2020年10月至2021年12月于鄂尔多斯市中心医院行DCE-MRI扫描的直肠腺癌患者43例，其中男 28例，女15例，年龄（67±11.4）岁，其中高分化组16例、中分化组21例、低分化组6例。纳入标准：①检查前未进行放化疗；②术后病理学诊断为直肠腺癌；③检查后一周内行直肠癌根治术，且术后病理资料完整。排除标准：①图像质量差，无法进行后处理者；②有MRI检查禁忌症者；③肿瘤体积太小无法准确测量者。

1.2 MRI检查方法

告知患者提前做好肠道清洁准备，检查前5分钟内通过注射盐酸消旋山莨菪碱20mg抑制肠道蠕动，避免运动伪影造成的影响。采用HDXT GD 3.0T磁共振扫描仪及腹部线圈，患者取仰卧位，DCEMRI扫描前行MRI常规平扫。扫描序列如下：①轴位 T1WI：TR550ms、TE8.9ms、FOV46x46cm、 层 厚6mm； ② 轴 位 抑 脂 T2WI：TR5280ms、TE140ms、FOV46x46cm、层厚 6mm；③冠状位抑脂 T2WI：TR5640ms、TE110ms、FOV43x45cm、层厚 5mm；④矢状 位 T2WI：TR5220ms、TE109ms、FOV32x32cm、 层厚 5mm； ⑤ T2WI 小 FOV：TR5220ms、TE109ms、FOV32x32cm、层厚 3mm；⑥轴位 DWI：TR5000ms、TE94.2ms、b=800s/mm2、FOV40x 40cm、 层 厚 6mm。DCE-MRI动态增强扫描，采用美国GE公司的LAVA序列。 参数如下：TE1.1ms，TR2.9ms，FOV40x40cm，层厚3.6mm。以病变为中心扫描5个蒙片（反转角度为3°，6°，9°，12°，15°）后，以 12°翻转角进行动态增强扫描，应用磁共振专用高压注射器通过肘静脉套管（20G）团注美国GE药业的造影剂欧乃影（钆双胺注射液），剂量为 0.2mmol/kg，速率为 3.5ml/s，注射完毕后紧接追加20ml生理盐水冲管，对比剂注射同时连续进行40个期相的动态增强扫描。总扫描时间为7分5秒。

1.3 图像分析及处理

使用OmniKinetics软件对DCE-MRI定量参数Ktrans值、Kep值和Ve值进行统计分析。获取动脉输入函数（Arterial Input Function，AIF）曲线模型，以病灶强化最为明显的区域为中心，手动绘制病灶感兴趣 区 （Region Of Interest，ROI），ROI 大 小 约 3.0-3.5cm2，且每个ROI测量3-5次取平均值。采用Extended Tofts Linear双室模型，获得Ktrans（容积转运常数）、Kep（速率常数）、Ve（细胞外间隙分数）的参数图谱，并自动生成Excel表格，最后整理数据。以上所有DCE-MRI定量资料的分析获取均由2名中级以上影像科医师各自独立分析完成后取平均值。见图1。

图1 患者男，65岁，肠镜提示直肠癌，病理提示中分化腺癌。1A：T2WI图像示直肠左前壁不均匀增厚 ；1B：Ktrans伪彩图，病变区Ktrans=0.750/min ；1C：Kep伪彩图，病变区Kep=0.458/min ；1D：Ve伪彩图，病变区Ve=0.631

1.4 免疫组化检测Ki67

将取下的肿瘤标本于福尔马林溶液固定后，采用石蜡包埋组织切片（4μm）用二甲苯预处理，梯度酒精水化。待应用pH值为6.0的柠檬酸盐缓冲液冲洗切片后进行烘干冷却。然后在室温下应用磷酸盐缓冲盐水清洗后加入抗体、二氨基联苯胺（DAB）显色剂、苏木精复染色等完成切片染色。Ki67阳性的定位位于细胞核，显示为在相应部位呈现棕黄色颗粒。随机选取5个高倍镜视野（×400）进行阳性细胞率的计算，同一视野中阳性细胞数与1 000个癌细胞之间的百分比为其增殖指数。最终的结果评定标准为［5］：镜检细胞中若Ki67阳性细胞数<10%为阴性（-），10%～50%为阳性（+），阳性细胞率>50%为强阳性（++）。且将其分为两组，其中Ki67低于50%的列为低表达组，高于50%的列为高表达组。见图2。

图2 直肠癌组织中Ki67表达 （免疫组化×200）A：Ki67高表达；B：Ki67低表达

1.5 统计学分析

数据处理使用Rstudio软件进行分析，使用ggplot2、ggsignif、pROC包绘图。所有计数资料待验证其正态性后，将符合正态分布的计量资料采用±s进行统计学描述；Ki67高表达组和低表达组之间的数据比较采用独立样本t检验的方式进行统计学分析；直肠癌高分化组、中分化组、低分化组组间比较采用Mann-Whithey U检验的方式进行统计学分析；比较不同DCE-MRI定量参数对诊断Ki67表达的灵敏度、特异度，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 分化程度与DCE-MRI定量参数的关系

在直肠癌不同分化程度的组间比较中（见表1），Ktrans值存在统计学差异 （F=5.969，P=0.005），Kep值和 Ve值无统计学差异 （F=1.111，P=0.339；F=0.121，P=0.886）。直肠癌高分化组的 Ktrans值为0.378±0.261/min，直肠癌中分化组的 Ktrans值为 0.742±0.627/min，直肠癌低分化组的 Ktrans值为 1.143±0.336/min。其中，高分化组Ktrans明显低于中分化组及低分化组，且具有统计学意义 （P=0.029，P=0.002）；而中分化组和低分化组之间的Ktrans无统计学差异（P=0.082）（见图 3）。

图3 直肠癌不同分化组DCE-MRI定量参数Ktrans箱图

表1 不同分化程度直肠癌的DCE-MRI定量参数比较（±s）

表1 不同分化程度直肠癌的DCE-MRI定量参数比较（±s）

变量 高分化组 中分化组 低分化组 F P Ktrans0.378±0.261 0.742±0.627 1.143±0.336 5.969 0.005 Kep 0.344±0.251 0.363±0.244 0.521±0.309 1.111 0.339 Ve 0.421±0.611 0.454±0.373 0.349±0.194 0.121 0.886

2.2 Ki67表达水平与DCE-MRI定量参数的关系

在 Ki67 低表达组（n=16）和高表达组（n=27）的比较中，两组间Ktrans和Kep值存在统计学差异 （t=2.682，P=0.014；t=2.386，P=0.0023）， 两组间的 Ve值无统计学差异（t=-0.135，P=0.800）。 Ki67高表达组的Ktrans值及Kep值显著高于低表达组且差异存在统计学意义，见表2。

表2 不同Ki67表达水平的DCE-MRI定量参数比较（±s）

表2 不同Ki67表达水平的DCE-MRI定量参数比较（±s）

变量 ki67高表达组 ki67低表达组 F P Ktrans 0.822±0.598 0.460±0.382 2.692 0.014 Kep 0.451±0.257 0.286±0.230 2.386 0.023 Ve 0.394±0.356 0.379±0.225 -0.135 0.800

2.3 DCE-MRI的定量参数对直肠癌肿瘤细胞中Ki67表达水平的ROC曲线分析

ROC曲线分析显示，Ki67两组间诊断Ktrans值的临界值为0.675/min，灵敏度和特异度分别为73%、41%；两组间Kep值的临界值为0.214/min，灵敏度和特异度分别为87%、53%。Ki67两组间诊断Ve值灵敏度及特异度均较低（46%，37%），见表3。

表3 不同Ki67表达水平的DCE-MRI定量参数效能分析

3 讨论

动态增强磁共振（DCE-MRI）的工作原理是通过静脉注射顺磁性钆类造影剂后，在规定时间内扫描出多期图像，进而从影像的不同表现中研究器官或肿瘤组织中造影剂的摄取情况［6］。因为造影剂的摄取量取决于微循环，所以将图像经过处理后可获得与微循环相关的灌注参数［7］。Ktrans（min-1）是指体积转移常数，它描述的是造影剂从血浆转移到组织的速率，间接反映肿瘤局部微血管的血流状态及通透表面积。Kep（min-1）是指转移速率常数，它描述了造影剂从血管外细胞外间隙到血浆室的回流速率，间接反映肿瘤微血管的生长状态。Ve（%）是指从血管外细胞外间隙渗透到血浆室中的部分体积，其大小代表EES中对比剂的容量，反映肿瘤细胞的增殖及坏死情况［8］。

DCE-MRI作为新兴的现代化影像技术，可以综合组织形态学和血流动力学变化的特征，从而进一步评估肿瘤的分化程度［9］。从本研究结果可以发现，直肠癌高分化组的Ktrans值显著低于中、低分化组，很有可能是因为分化程度低的肿瘤因组织缺氧情况严重，进而刺激血管进入再生状态，灌注量明显增加，血管渗透面积随之增大。除此之外，分化程度低的肿瘤在细胞形态学和组织学上均表现出更高的异质性。由于细胞密度的增高，细胞间质变小，因而Ktrans值更高。本研究中的Kep值和Ve值与肿瘤分化程度高低均没有明显相关性，这与Shen等（2016）［9］研究结果相一致。虽然Kep值和Ve值与肿瘤的血管外、细胞外空间组成有关，但在不同分化状态的病变中，血管外、细胞外空间的组成并没有明显差异。Ki67是一项反映细胞增殖的标志物，在细胞分裂进展中起到重要作用，且其表达的高低程度与细胞增殖高度相关［10-11］。本研究结果显示，Ki67高表达组的Ktrans值、Kep值均高于低表达组的值，但Ve值的高低与肿瘤细胞中Ki67表达的多少无明显相关性。Ki67高表达提示肿瘤增殖更加活跃，微血管增多，微循环加速，因此Ktrans、Kep值升高。本研究DCEMRI定量参数的ROC曲线分析显示，Ktrans、Kep对评估直肠癌Ki67表达程度具有较高的灵敏度，可为直肠癌ki67表达程度提供参考。当然，本研究也存在一定的不足。首先，进行收集且符合入组标准的样本量偏少。其次，Ki67表达程度需进一步细化分组，进行与DCE-MRI定量参数的相关性研究。这些不足可能会对结果造成偏倚。后续为了确保DCEMRI定量参数在直肠癌诊疗中的可参考性，还需要对大量样本进行研究。

综上所述，DCE-MRI定量分析弥补了常规磁共振只进行形态学评估的不足，能在一定程度上无创地反映直肠癌分化程度和Ki67表达情况，为临床诊疗提供依据。