基于HS-SPME-GC-MS和电子鼻技术对干枣及其不同提取物挥发性成分分析

黄贵元，赵海娟，高 阳，许利平，许高燕，吴兆明，李瑞丽，梁 淼,，张峻松,

（1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南 郑州 450002；2.河南中烟工业有限责任公司安阳卷烟厂，河南 安阳 455006；3.浙江中烟工业有限责任公司，浙江 杭州 310008）

新郑大枣，又名鸡心大枣、鸡心枣，是枣科鸡心枣属植物的成熟果实。新郑大枣具有较高的VC含量和良好的抗氧化活性，可用作功能性水果，但鲜枣的货架期极短，在非受控条件下，通常不超过10 d，因此鲜枣多被干制并加工成相关产品。干制后的大枣具有丰富而独特的香气，浓郁的枣甜香略带酸味。通常利用提取技术获取干枣提取物，并将其添加于食品中以赋予干制大枣的香气特征，因此干枣提取物已被列入“食品添加剂清单”，可作为食品添加剂和调味剂，广泛应用于食品、天然香精香料等行业。例如，添加了干枣水提物的白面包颜色、风味、味道和总体口感都得到较好的提升。研究表明干枣提取方法、提取溶剂等条件对提取物的香味成分及作用影响较大，并且提取物与干枣自身的香味也存在一定差异。然而，目前关于干枣及其不同提取物之间的香气差异性研究较少，系统对比干枣及其不同提取物的香气品质差异，可以为干枣及其提取物的定向精准使用提供数据支撑。

气相色谱-质谱（gas chromatography-masss pectrometry，GC-MS）可以分离、鉴定和量化干枣及其提取物的挥发性成分，然而GC-MS结果不能直接体现其感官品质，而电子鼻可以通过模仿人类的嗅觉功能来识别风味。将2 种技术相结合对风味进行分析，可以起到良好的验证和相互补充的作用，能更好地区分枣及其不同提取物的风味化合物的特征差异。近年来顶空固相微萃取-GC-MS（headspace solid phase microextraction-GC-MS，HS-SPME-GC-MS）联用结合电子鼻对挥发性成分的分析日臻成熟，已成功应用于桃、脱脂奶、松子等的香气分析，对于不同品种、成熟期、贮藏期、干制方法枣的香气品质有较好识别，也为干枣提取物挥发性成分分析提供了技术手段。

因此，本实验利用HS-SPME-GC-MS结合电子鼻技术分别对干枣、不同提取方法获得的枣浸膏及净油的挥发性成分进行分析，研究不同加工方法对其香气品质的影响行为，以明确干枣及其提取物挥发性成分之间的差异，为干枣提取物的应用提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料

新郑大枣，于2020年10月购自新郑枣健康食品有限公司。

1.2 仪器与设备

7890B-5977B GC-MS联用仪 美国Agilent公司；手动SPME进样器、65 μm PDMS/DVB萃取头 美国Supelco公司；PEN3.5便携式电子鼻 德国Airsence公司；B13-3智能恒温定时磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司；XH-200A电脑微波固液相合成/萃取仪 北京祥鹄科技发展有限公司；N-1300V-WB旋转蒸发器 东京理化器械株式会社；EL204分析天平 美国Mettler-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

将干枣去核、粉碎（3 mm×3 mm×3 mm），自封袋保存于－20 ℃备用，得到干枣样品。

浸膏分别采用加热回流和微波辅助热回流的方法制备，操作如下：称取一定量的干枣样品，加入体积分数80%乙醇溶液，85 ℃加热3 h，提取2 次，合并提取液后，旋转蒸发去除溶剂，得加热回流枣浸膏（heat reflux jujube extract，HJE）；称取一定量的干枣样品，加入体积分数90%的乙醇溶液，400 W微波提取15 min，提取2 次，合并提取液后，旋转蒸发去除溶剂，得加微波辅助热回流枣浸膏（microwave-assisted heat reflux jujube extract，MJE）。

将制得的2 种枣浸膏分别加入体积分数95%乙醇溶液，60 ℃水浴搅拌1 h，抽滤后将提取液于－20 ℃冷冻24 h后，及时抽滤，旋蒸去除溶剂，分别得到加热回流枣净油（heat reflux jujube absolute oil，HJO）和微波辅助热回流枣净油（microwave-assisted heat reflux jujube absolute oil，MJO）。枣浸膏和枣净油于4 ℃条件下保存备用。

1.3.2 HS-SPME条件

精确称取2 g样品，置于20 mL顶空瓶中，密封，样品在50 ℃条件下平衡40 min，然后在持续加热和搅拌（250 r/min）条件下，插入萃取头，萃取30 min后插入GC-MS进样口，于250 ℃解吸3 min。

1.3.3 GC-MS分析条件

GC条件：HP-5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃；升温程序：初始温度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至120 ℃，然后以10 ℃/min升至200 ℃，保持5 min；载气为氦气，流量为1.0 mL/min；采用不分流模式进样。

MS条件：电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；传输线温度250 ℃；采集为全扫描模式，质量采集范围/35～550。

采用NIST14质谱数据库检索，选择匹配度不小于85的峰确定各香味物质。每个样品测定重复3 次。

1.3.4 电子鼻分析条件

精确称量0.1 g样品，加入40 mL吹扫捕集瓶中，拧紧瓶盖，于室温放置20 min后开始用电子鼻检测。传感器清洗时间120 s；归零时间10 s；样品准备时间5 s；样品采集时间60 s，载气为洁净空气，载气和样品气体流量均为30 mL/min，每个样品测定重复3 次。10 种传感器的敏感物质见表1。

表1 PEN3.5电子鼻传感器敏感物质Table 1 Performance description of PEN3.5 electronic nose sensors

1.4 数据处理

所有统计分析均使用SPSS 21软件进行，用Duncan多重比较验证干枣及其不同提取物的挥发性成分在＜0.05水平上的差异显著性；挥发性成分的热图和层次聚类分析采用Morpheus在线软件进行；电子鼻数据采用Winmuster软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 结果与分析

2.1 HS-SPME-GC-MS分析干枣及其不同提取物的挥发性成分

如图1所示，利用HS-SPME-GC-MS方法从干枣及其提取物中共检测出96 种挥发性物质，干枣、HJE、MJE、HJO和MJO样品中分别检测出59、49、43、53 种和58 种挥发性成分，结果如表2所示。

图1 干枣及其不同提取物的总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms of dried jujube and its different extracts

酯类化合物是水果香气成分中最主要的一类物质，成熟水果的香气主要取决于酯类物质。由表2可以看出，干枣及其不同提取物中酯类香味成分的种类最多，但在另一项研究中，杂环类化合物为枣提取物中的主要挥发性成分，这可能与枣的提取方法不同有关。一些低级脂肪酸甲酯（己酸甲酯、庚酸甲酯、辛酸甲酯）仅在干枣中检测出。酯类来源于脂肪氧合酶的代谢途径，这些小分子酯类可能是一些脂肪酸甲酯化的次级代谢产物。它们大多具有水果香气，对于干枣香气的形成具有重要作用。此外，干枣中检测出了5 种内酯类物质，内酯类物质是果香的重要贡献化合物，但其相对含量较低（4.375%），并且在几种提取物中，内酯类化合物的相对含量均显著降低（0.714%～1.107%）。

表2 干枣及其不同提取物挥发性物质含量变化Table 2 Composition and content of volatile constituents in dried jujube and its different extracts

续表2

续表2

干枣及其不同提取物中酸类物质的相对含量均较高（31.273%～44.433%），己酸、庚酸、正辛酸和正癸酸在干枣及其不同提取物中均有检出，它们呈现出奶酪和脂肪香气。干枣及MJE中己酸为相对含量最高的酸类物质（分别为17.349%和21.480%），而其余3 种提取物中含量最高的酸类物质为正癸酸（9.542%～15.474%）。此外，在几种枣提取物中发现了较高含量的苯甲酸，这可能与苯甲醛的氧化有关。

干枣及其不同提取物中醇类物质的相对含量和种类数均较低。其中，苯乙醇仅在MJE和MJO中检测到，相对含量分别为0.190%和0.210%。干枣中仅检测到蘑菇醇，其相对含量为3.046%。醛类物质中，苯甲醛在干枣中相对含量最高，为22.704%。另外，HJO和MJO

中均检测到了香草醛，它不仅具有甜香和奶油香气，还有一定的药理作用。环戊烯酮和2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4()-吡喃-4-酮仅在HJE和HJO中发现，它们被认为具有焦糖和甜香。杨鹏元等对枣乙醇提取物进行分离分析发现，2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4()-吡喃-4-酮、麦芽酚和4-环戊烯-1,3-二酮等7 种挥发性成分为枣的烤甜香特征成分，但在本研究中仅检测到其中的2 种。值得指出的是，在干枣及其不同提取物中首次发现巨豆三烯酮，它是叶黄素的降解产物，具有干草样甜香。所检测出的其余种类物质对干枣及其不同提取物的香气形成贡献不大。

由上述分析可得，干枣及其不同提取物中的主要香气物质为酸类、酯类、醛类和酮类。由图2可知，干枣经过不同处理后，几类主要化合物的相对含量呈现出不同的变化规律。醛类物质相对含量最高的为干枣（25.128%），其次为2 种浸膏（7.258%～8.496%），而2 种净油最低（1.801%～2.012%），这种醛类含量随样品热处理强度的增加而降低的趋势与醛类物质自身稳定性有关，热处理会加速醛的氧化，导致其相对含量下降。与醛类不同的是，酮类物质在HJE和HJO中的相对含量明显高于其余3 种样品（＜0.05），表明加热回流提取利于酮类物质的生成及富集。这些酮类香气物质的产生与美拉德反应有关，而微波辅助热回流提取的时间较短，反应程度不够，因此未形成这些酮类香气物质。

图2 干枣及其不同提取物中主要化合物相对含量Fig.2 Contents of acids,aldehydes,ketones and esters in dried jujube and its different extracts

此外，由图2可以看出，2 种提取方法对于获得酸类和酯类物质效果有差异，加热回流提取对于酸类物质的提取效率更高，而微波辅助热回流提取则对酯类的提取效率更高。另外，同种提取方式下，浸膏和净油中的酸类和酯类物质分布整体规律：酸类物质相对含量为HJE＞HJO、MJO＞MJE，酯类物质相对含量为HJO＞HJE、MJE＞MJO，浸膏和净油中的酸类和酯类物质的相对含量互为补充，这可能与浸膏制备净油过程中酸类和酯类的相互转换有关。

2.2 干枣及其不同提取物挥发性成分的热图和层次聚类分析

为了直观清晰地了解干枣及其不同提取物挥发性成分含量的异同，对5 个样品检测出的96 种挥发性成分的相对含量进行热图和层次聚类分析，结果如图3所示。热图中方块颜色由蓝到红代表挥发性成分含量由低到高。

由图3可以看出，干枣及其不同提取物分为3 组：干枣为1 组，MJE为1 组，HJE、HJO和MIO为1 组。其中，HJE和HJO被分在同一分支上，表示其挥发性成分分布没有显著差异，这与两者具有较接近的酮类物质有关。干枣没有与任何提取物分组在相同的分支上，说明干枣的挥发性成分分布不同于几种提取物，这主要与干枣中醛类、内酯类和烃类含量较高有关。MJE未和其余几种提取物中的一种分为一组，这是因为它在部分挥发性成分上的分布和干枣接近（己酸、月桂酸甲酯等）。此外，从图3还可以明显看出，庚酸、正辛酸、己酸、月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯和肉豆蔻脑酸甲酯在干枣及其不同提取物中的分布相近，其中月桂酸甲酯呈现典型的枣香味，肉豆蔻脑酸甲酯呈焦香风味，它们曾被鉴定为大枣中的典型香气成分。

图3 干枣及其不同提取物香气成分的热图和层次聚类分析Fig.3 Heat map and hierarchical cluster analysis of the aroma components of dried jujube and its different extracts

2.3 干枣及其不同提取物挥发性成分的电子鼻响应分析

图4以干枣和HJO为例，展示了电子鼻传感器对它们的响应，每条曲线显示了相应传感器响应值随时间延长的变化。由图4和图5可以看出，不同样品的响应值高低为净油＞干枣＞浸膏，这与GC-MS的结果一致（图1）。浸膏中含有较大量的糖，呈半固态，异常黏稠，在室温条件下，香味成分较难突破屏障，是整体响应值较低的主要原因。净油经过2 次提取，除去了大量的糖类、蛋白质等的大分子物质，呈流体状，挥发性成分含量明显提升，整体响应值相应提高。

图4 电子鼻传感器对干枣（a）和HJO（b）的响应图Fig.4 Responses of electronic nose sensors to dried jujube (a) and heat reflux jujube absolute oil (b)

图5 干枣及其不同提取物的电子鼻数据雷达图Fig.5 Radar chart of electronic nose data for dried jujube and its different extracts

干枣中S7（对萜类和含硫化合物敏感）的响应值最高，其次是S9（对芳香族化合物和有机硫化物敏感）、S6（对烷烃敏感）、S8（对醇类、部分芳香族化合物敏感）和S2（对氮氧化合物非常敏感），这与Chen Qinqin等对鲜枣的电子鼻分析结果略有不同，说明干制会对枣的风味造成影响。干枣中萜烯类物质相对含量仅为0.400%，而其S7的响应值为最高，原因是壬醛、己酸及低级脂肪酸甲酯等具有类似萜烯结构的物质可以显著增加S7的响应值。与干枣不同的是，HJE、HJO、MJE和MJO中响应值最高的均为S6，这可能是因为这4 种提取物中高级脂肪酸单酯相对含量较高，高级脂肪酸单酯的碳链较长，其结构与烷烃较为接近，会使S6的响应值明显增加。此外，HJE和HJO中具有较高相对含量（16.292%和17.194%）和种类（8 种和10 种）的酮类物质，但这在电子鼻传感器的响应中没有体现出来，这意味着电子鼻对于这些酮类物质不敏感。HJE、HJO、MJE和MJO中S9、S7、S8和S2这4 种传感器的响应值也相对较高，趋势与干枣基本一致。

2.4 干枣及其不同提取物挥发性成分的电子鼻PCA和载荷分析

对5 个样品的10 种电子鼻传感器响应值进行PCA和载荷分析，如图6a所示，PC1的贡献率为91.45%，PC2的贡献率为7.79%，前2 个PC的总贡献率为99.24%，超过了90%，说明前2 个PC足以解释总方差。

PCA结果表明，干枣及其不同提取物可以分为4 组：干枣为1 组，MJE为1 组，HJE为1 组，HJO和MJO为1 组。除HJE外，结果与聚类分析结果较一致。HJE未与HJO和MJO分为一组，这主要与HJE中香气成分含量相对较低有关（图1）。HJO和MJO相互接近，说明它们具有相似的香气，而HJE和MJE之间有较远距离，这表示它们具有显著不同的风味，这和GC-MS的结果一致。HJE和MJE中分别具有较高含量的酸类和酯类物质，而经过进一步提取的HJO和MJO中这2 类物质的含量趋于平衡，使它们的香气更加协调一致。

由图6b可以看出，对PC1贡献率最大的是S6传感器，其次为S8传感器；对PC2贡献率最大的是S7传感器，而S9传感器对PC1和PC2贡献率都较大。选择这4 个传感器进行实验，结果见图6c，这4 个传感器的贡献率高达99.24%。因此，S6（W1S）、S7（W1W）、S8（W2S）和S9（W2W）为识别干枣及其不同提取物香气的特征传感器。

图6 干枣及其不同提取物电子鼻PCA图和载荷图Fig.6 PCA and loading analysis of electronic nose sensor data for dried jujube and its different extracts

3 结论

利用HS-SPME-GC-MS结合电子鼻技术对干枣及其不同提取物的挥发性成分进行分析。结果表明：干枣及其不同提取物中的主要香气成分为酸类、酯类、醛类和酮类物质；不同提取方式得到的提取物中挥发性成分存在较大差异，加热回流提取对于酸类物质的提取效率较高，微波辅助热回流提取则对酯类的提取效率较高；聚类分析和PCA分别将干枣及其不同提取物划分为3 组和4 组，两者的区别在于HJE，这与HJE中香气成分含量相对较低有关；电子鼻的载荷分析显示，W1S、W1W、W2S和W2W为识别干枣及其不同提取物香气的特征传感器。总而言之，GC-MS香味成分分析与电子鼻的分析结果是较为一致的，两者的结合可以对干枣及其不同提取物的挥发性成分进行综合分析。