伊维菌素合成产物中杂质的分离与鉴定

高月麒，王克华，马志珺，林 旸，李晓露*，任风芝*

(1.华北制药集团新药研究开发有限责任公司 微生物药物国家工程研究中心 河北省工业微生物代谢工程技术研究中心，河北 石家庄 052165；2.华北制药集团爱诺有限公司，河北 石家庄 052165)

近年来，随着环境保护意识的增强及绿色生态农业的发展，生物农药在农药领域倍受青睐。阿维菌素类生物农药，因具有选择性高、低毒无公害、与环境相容性好等特点，受到研究者的重视。伊维菌素为十六元环结构的大环内酯类抗生素，通过阿维菌素B1a的C22、C23位上的双键加氢还原而成，比阿维菌素结构更稳定、安全性更高、持效期更长[1-2]。伊维菌素由于具有高效、用量少、副作用小等特点，广泛应用于牛、马、猪、羊的肺线虫及胃肠道线虫的治疗[3-6]。

随着公众对药品安全的日益关注，国内外对药物杂质的研究越来越重视，ICH及国家食品药品监督管理局都相继发布了杂质研究的指导原则，国外药典也对杂质进行了相应的规定。为满足伊维菌素注册需求、与国际接轨，作者以阿维菌素为起始原料，经催化加氢反应得到伊维菌素粗品，采用二维色谱纯化技术对伊维菌素粗品中的关键杂质进行分离提纯，并对杂质的结构进行鉴定，拟为伊维菌素的质量研究和高端认证提供技术支持。

1 实验

1.1 试剂与仪器

阿维菌素B1a(纯度≥98.5%)，华北制药集团爱诺有限公司；乙腈，色谱纯，Merck公司；甲苯、甲醇，分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；纯化介质(UniSil C18)，苏州纳微科技股份有限公司；纯化水，自制。

OptiMax 1001型反应釜，梅特勒-托利多公司；高效液相色谱仪(SPD-M20A 型紫外检测器)，日本岛津公司；二维液相制备系统，北京创新通恒科技有限公司；T-1000型天平，常熟双杰测试仪器厂；AVANCE Ⅲ-500型核磁共振波谱仪，Bruker公司；LC-MS(ACQUITY UPLC系统，Xevo TQ MS型质谱检测器，2998型PDA检测器，Masslynx工作站)，Waters公司。

1.2 伊维菌素粗品的合成

在反应釜中加入甲苯300 mL、阿维菌素B1a原粉100 g，在氮气搅拌下加入催化剂1.5 g，升温至70 ℃，通入氢气进行加氢反应，反应液过滤、干燥，即得伊维菌素粗品95 g。

1.3 伊维菌素杂质的分离纯化

将伊维菌素粗品用甲醇溶解，经中压柱(填料UniSil C18，30 μm，1 000 mL)进行初分离，洗脱剂为甲醇-水(85∶15，体积比，下同)，根据洗脱峰分段收集洗脱液，洗脱液减压浓缩、干燥，即得高比例的杂质粗品。

将杂质粗品用甲醇溶解，经0.45 μm滤膜过滤，采用二维液相制备系统进行分离纯化，按照色谱图出峰分别进行目标馏分的收集，收集液减压浓缩、干燥，即得伊维菌素杂质纯品。

1.4 检测条件

制备色谱条件：UniSil C18色谱柱(30 mm×250 mm,10 μm)，洗脱剂为乙腈-甲醇-水(54∶12∶34)，流速为16 mL·min-1，检测波长为245 nm。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正、负离子检测，离子源温度为150 ℃，电离电压为3.0 kV，电喷雾接口干燥气(N2)流速为600 L·h-1，锥孔电压为30 V，脱溶剂气温度为350 ℃。

核磁共振条件：样品用CDCl3溶解，用500 MHz型波谱仪检测。

2 结果与讨论

2.1 伊维菌素粗品的HPLC分析(图1)

由图1可知，在阿维菌素加氢反应过程中，除生成主产物伊维菌素外，也生成了副产物杂质1、杂质2、杂质3、杂质4。

2.2 伊维菌素杂质的分离纯化

采用二维色谱纯化技术对伊维菌素粗品中的主要杂质进行分离提纯，得到4个杂质纯品，杂质1、杂质2、杂质3、杂质4的质量分别为35 mg、20 mg、27 mg、45 mg，其色谱纯度均大于95%，分别为98.6%、95.7%、97.1%、99.1%。

2.3 伊维菌素杂质的结构表征

2.3.1 质谱分析(图2)

图2 伊维菌素杂质的质谱图

2.3.2 核磁共振波谱分析

13CNMR、1HNMR数据分别见表1、表2。

表1 伊维菌素杂质的13CNMR数据

表2 伊维菌素杂质的1HNMR数据

2.4 伊维菌素杂质的结构鉴定

杂质1：由ESI+准分子离子峰图谱得到m/z873[M+H]+，m/z890[M+NH4]+；由ESI-准分子离子峰图谱得到m/z871[M-H]-。推定杂质1的相对分子质量为872。由核磁共振波谱数据可知，杂质1的13C化学位移和1H化学位移与文献[7-8]中阿维菌素B1a的一致，确定杂质1为阿维菌素B1a。

杂质2：由ESI+准分子离子峰图谱得到m/z878[M+NH4]+；由ESI-准分子离子峰图谱得到m/z859[M-H]-，m/z905[M-H+HCOOH]-。推定杂质2的相对分子质量为860，较杂质1的相对分子质量少12。比对杂质2与杂质1的核磁共振波谱数据，发现差别在C3′a位碳信号消失，推测-OCH3变为了-OH；且C22、C23位双键消失，而增加了化学位移为δ35.88和δ28.20的两个碳信号，说明杂质2的C22、C23位为饱和键。综上，确定杂质2为3′-OH-H2B1a。

杂质3：由ESI+准分子离子峰图谱得到m/z748[M+NH4]+；由ESI-准分子离子峰图谱得到m/z729[M-H]-。推定杂质3的相对分子质量为730。比对杂质3与杂质1的核磁共振波谱数据，发现差别在C14a、C15～C20位碳信号消失；且C22、C23位双键消失，而增加了化学位移为δ35.90和δ28.21的两个碳信号，说明杂质3的C22、C23位为饱和键。综上，确定杂质3为EP9.0中有关物质H。

杂质4：由ESI+准分子离子峰图谱得到m/z894[M+NH4]+；由ESI-准分子离子峰图谱得到m/z921[M-H+HCOOH]-。推定杂质4的相对分子质量为876，较杂质1的相对分子质量多4。比对杂质4与杂质1的核磁共振波谱数据，发现差别在C3、C4位双键消失，而增加了化学位移为δ31.24和δ34.66的两个碳信号，说明杂质4的C3、C4位为饱和键；且C22、C23位双键消失，而增加了化学位移为δ35.94和δ28.18的两个碳信号，说明杂质4的C22、C23位为饱和键。综上，确定杂质4为EP9.0中有关物质K(H4B1a异构体)[9]。

杂质1、杂质2、杂质3、杂质4的结构式见图3。

图3 杂质1、杂质2、杂质3、杂质4的结构式

3 结论

采用二维色谱纯化技术，从伊维菌素合成产物中分离得到4个杂质，并对杂质的结构进行了鉴定。结果发现，4个杂质的结构与伊维菌素骨架结构一致，均为同系列化合物，其中杂质1为阿维菌素B1a，杂质2为3′-OH-H2B1a，杂质3为EP9.0中有关物质H，杂质4为EP9.0中有关物质K(H4B1a异构体)。该研究通过对伊维菌素合成产物中杂质的归属研究，为产品的国内外注册及进入国际高端市场提供了有力支持，同时在更好地控制产品质量、保障用药安全方面具有十分重要的意义。