中华猕猴桃与软枣猕猴桃种间杂交亲本的筛选

杜 奎，王丽华，张 茜，谢 王月，李利军，庄启国，李峤虹，李明章，王永志

（四川省自然资源科学研究院 中国—新西兰猕猴桃“一带一路”联合实验室、猕猴桃育种及利用四川省重点实验室，四川 成都 610041）

0 引言

猕猴桃起源于中国，是我国重要的特色经济水果。猕猴桃隶属于猕猴桃科（Actinidiaceae）猕猴桃属（Actinidia Lindl.），营养丰富［1，2］，素有“水果之王”的美誉。猕猴桃属分为54 个种，21 个变种，共75 个分类单元［3］，目前栽培利用的主要为中华猕猴桃（Actinidia chinensis Planch.var.chinensis）、美味猕猴桃（A.chinensis var.deliciosa A.Chevalier）和少量软枣猕猴桃（A. argute（Sieb.＆ Zucc）Planch.ex Miq.）。中华猕猴桃果实大、口感好、较耐贮藏，适于鲜食，许多主栽品种均属此类，如‘红阳’、‘金实1 号’［4］、‘东红’［5］、‘平原红’［6］、‘贝木’［7］。但中华猕猴桃溃疡病抗性和抗寒耐旱能力较差，主要种植于我国南方地区。美味猕猴桃产量高、抗病性强，大多数品种口感偏酸，适于加工和作砧木，在陕西、贵州、湖南等地广泛栽培。软枣猕猴桃因果面连皮食用，营养美味，成熟期早，抗寒性强且高抗溃疡病［8，9］，极具市场发展潜力。目前，软枣猕猴桃育种主要通过野生资源筛选。截至2017 年，世界软枣猕猴桃品种已达到74个之多，仅我国就有11 个［10］，但是果实普遍较小、贮藏性能差（2—3 周），产业发展受限。

种间杂交可以打破种属间的隔离，把亲本有益特性重新组合，使之形成新类型或新种，这些新类型或新种可能具有种内杂交所不能获得的优良特性［11］。由于种间杂交后代群体类型多样，因此种间杂交是创造果树新种质常用和重要的途径［12］。Wang 等［13］用普通枇杷与南亚枇杷杂交，获得了具有春季开花习性的‘春花1 号’，该品种可以有效规避花期冻害，且果实内在品质优于双亲；黄宏文［3］通过中华猕猴桃与毛花猕猴桃杂交，选育出了低糖低酸新品种‘金艳’。目前尚无中华猕猴桃与软枣猕猴桃杂交获得后代的报道。

利用中华猕猴桃与软枣猕猴桃种间杂交可以综合双亲的优良性状，从而培育果大质优、耐贮藏且抗溃疡病的猕猴桃新品种。猕猴桃不但种质资源丰富、个体差异巨大，而且是雌雄异株植物，父本具有不确定性，又存在杂交亲和性的问题，增加了杂交亲本选择的难度。为了低成本、高效率地获得理想的育种目标，需要对杂交亲本进行慎重筛选。在猕猴桃亲本筛选的众多因素中，染色体倍性、物候期、果实品质最为关键。猕猴桃染色体倍性存在广泛的变异，中华猕猴桃（原变种）有二倍体、四倍体两个倍性小种，软枣猕猴桃有四倍体和六倍体两个倍性小种。通常，相同倍性品种杂交，其亲和力强，有利于形成杂交种子，且杂交种子发芽率高；而不同倍性品种杂交，种子常败育，难以形成饱满种子［14，15］。前人研究表明，多倍体猕猴桃通常比相同种类二倍体猕猴桃具有果实更大、耐贮藏、货架期长、抗逆性强等优良特性［16］，因此在选择杂交亲本时被优先考虑。尽管相同倍性材料种间杂交亲和力强而更容易获得成功，但也有研究表明不同倍性的种类杂交可以获得多种倍性小种，例如二倍体软枣猕猴桃与六倍体美味猕猴桃杂交可以获得二倍体、五倍体、六倍体3 种类型［17］。可见，可以根据研究目的筛选不同倍性种类作为亲本。此外，果树的物候期是植物器官受一年内季节气候条件制约而发生相应动态变化，与农事管理、上市时间关系密切，而果实的外观、内在品质和贮藏性是最重要的评价指标。

本文以不同来源的42 份中华猕猴桃和14 份软枣猕猴桃为材料，检测两种猕猴桃的染色体倍性，调查物候期，评价果实感官品质、主要营养成分和耐藏性，为种间杂交亲本材料的筛选提供参考依据。

1 实验材料与方法

1.1 材料

所选实验材料均来源于四川省自然资源科学研究院什邡科研基地（四川省什邡市）3 年以上树龄的健壮猕猴桃植株，实验时间为2018—2020 年。

1.2 方法

染色体倍性检测：取新鲜未展开幼嫩叶片0.5cm2置于培养皿中；取400μl CyStain UV Precise P 裂解液于植物叶片周围，用刀片将叶片切碎，提取30s；将培养皿中的液体用30μm 滤网过滤至样品管中；向样品管中加入1600μl 的CyStain®UV Precise P 染液，染色30s，用流式细胞仪进行测试。由样本的荧光强度Mean- x 判断倍性，4x 荧光强度=2x 荧光强度×2。以二倍体“红阳”猕猴桃为对照（2n = 2x = 58），至少检测2000 个细胞。

物候期调查：调查并记录全部所选材料连续3年内猕猴桃植株主要的物候期，即萌芽期、展叶期、花期、果实成熟期（雌株）和休眠期。基于亲本选择而非品种选育目的考虑，未细分每个物候期。

果实感官评价：在果实成熟期内每个单株随机取6 个果实，参考《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 猕猴桃属》（NY/T 2351 - 2013），记录果形、果皮颜色、果肉颜色，测定单果重、可溶性固形物含量、干物质含量等。软枣猕猴桃单果重的测算以20 个果实为一组，取平均值。取果柄和花萼端果肉挤汁混合，用数显糖度计检测可溶性固形物含量。称取15g鲜果肉，切薄片后置于恒温干燥箱65℃烘24h后称重，计算干物质含量。干物质含量（%）=干重/鲜重×100%，重复3 次。

果实主要营养成分测定：待软枣猕猴桃‘宝贝星’、‘魁绿’、HN - AA - 03067 果实自然软熟后，去除果皮，取中心果肉测定蛋白质、维生素C、维生素B2、可溶性糖、总酸、K、Na、Ca、Mg、Zn、Fe、Se 等含量。利用凯氏定氮法（GB 5009.5 - 2016）测定蛋白质含量，高效液相色谱法（GB/T 5009.86-2016）测定维生素C含量，高效液相色谱法（GB 5009.85 - 2016）测定维生素B2含量，3，5-二硝基水杨酸比色法（NY/T 2742-2015）测定可溶性糖含量，酸碱滴定法（GB/T 12456- 2008）测定总酸含量，电感耦合等离子体发射光谱法（ICP- OES）（GB 5009.268 -2016）测定K、Na、Ca、Mg、Zn、Fe元素含量，氢化物原子荧光光谱法（GB 5009.93-2017）测定Se含量。

果实耐贮性测试：每份材料随机取成熟果实12个，置于果盘中，1 ± 0.5℃条件下存放91d 后，统计出现斑点或腐烂、失水的果数。取5 个果实测定压力（硬度测试），取平均值，3 次重复。

数据分析：采用Origin 8 软件中的Turkey 对部分指标做差异显著性检验，差异检测水平为0.05。

2 实验仪器与试剂

2.1 仪器

实验所使用的主要仪器包括流式细胞仪、数显糖度计、硬度计、自动凯氏定氮仪、定氮蒸馏装置、高效液相色谱仪、电感耦合等离子体质谱仪、微波消解仪、原子荧光光谱仪等。

2.2 试剂

实验所使用的主要试剂包括：CyStain®UV Precise P裂解液、溴甲酚绿指示剂（C21H14Br4O5S）、亚甲基蓝指示剂（C16H18ClN3S·3H2O）、偏磷酸（HPO3）n、磷酸三钠（Na3PO4·12H2O）、L-半胱氨酸（C3H7NO2S）、十六烷基三甲基溴化铵（C19H42BrN）、L（+）-抗坏血酸标准品、D（+）-抗坏血酸（异抗坏血酸）标准品、三水乙酸钠（CH3COONa·3H2O）、木瓜蛋白酶、高峰淀粉酶、葡萄糖（C6H12O6）、维生素B2标准品（C17H20N4O6）、3，5 -二硝基水杨酸（DNS）、酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O）、亚 铁 氰 化 钾［K4Fe（CN）6·3H2O］、乙 酸 锌［（CH3COO）2Zn］、氩 气（Ar）、氦 气（He）、金元素（Au）溶液、硼氢化钠（NaBH4）、铁氰化钾［K3Fe（CN）6］、硒标准溶液，等；试剂均为国产，分析纯。

3 结果及分析

染色体倍性检测：本文利用流式细胞仪对42 份中华猕猴桃、14 份软枣猕猴桃材料进行了染色体倍性测定。结果表明：14 份软枣猕猴桃均为四倍体，包括绿肉品种‘魁绿’和红肉品种‘宝贝星’；42 份中华猕猴桃雌雄株均含有二倍体、四倍体倍性小种，其中四倍体雌株4 份（JXFX - CK - 04186OP1、05D、11E、‘金 实 1 号’）、雄 株 6 份（JXQS - CK -04266OP1、JXQS- CK- 04249OP2、JXFX- CK- 04137-OP32、JXFX - CK - 04136OP6、JXFX - CK - 04198、SF- M0833）。不同猕猴桃资源的基础信息及其染色体倍性如表1 所示。

表1 不同猕猴桃资源的基础信息及其染色体倍性Table 1 Basic information and chromosome ploidy of Actinidia resources

（续表1）

猕猴桃物候期调查：从表2 可见，中华猕猴桃与软枣猕猴桃的萌芽期、展叶期、花期接近。中华猕猴桃萌芽期集中分布于3 月上中旬，展叶期为3 月中旬至4 月中旬，花期大部分为4 月中下旬，最晚可达5月上旬（SF- F0811、05D）；软枣猕猴桃萌芽期为2月下旬至3 月上旬，展叶期为3 月中下旬，花期除JXFX-AA - 04021 为5 月上旬外，其他均为4 月下旬。两种猕猴桃果实成熟期和休眠期差别较大，中华猕猴桃成熟期跨度为9 月中旬至10 月下旬，软枣猕猴桃集中为8 月上中旬；中华猕猴桃休眠期始于12 月，比软枣猕猴桃晚1 个月左右。

表2 猕猴桃物候期调查Table 2 Phenological period of Actinidia resources

（续表2）

果实感官评价：果实的感官评价可以引导消费行为，是育种研究的一个重要参考。为了筛选合适的母本，从受试材料中抽取9 份中华猕猴桃和3 份软枣猕猴桃果实进行感官评价，将果形、颜色、果心硬度、单果重、可溶性固形物含量和干物质含量作为评价指标（图1、表3）。口感测试表明，两种猕猴桃软熟后果心都软，不存在“硬心”现象，但其他感官指标呈多样性。中华猕猴桃单果重和可溶性固形物含量显著高于软枣猕猴桃（P ＜0.05）。中华猕猴桃果实为卵形或椭圆形，果皮偏褐色，果肉颜色多样，果实大小变异较大。根据果实大小的显著性差异，可将受试中华猕猴桃分为3 组。05D 最大（121.1g），显著高于其他材料（P ＜0.05），其次为‘金实1 号’和11E，单果重80g 左右；‘红阳’等其他材料单果重最小，约为40g（非商品果园）。但可溶性固形物含量，05D最低，仅为11.7%，显著低于其他材料（P ＜0.05）；SF - F0814 最高，为18.3%。干物质含量，05D为最低的14.7%，其他均在20%左右。软枣猕猴桃果形为椭圆形至长椭圆形，表皮为绿色，单果重均在7g以下，差异不显著（P ＞0.05）。可溶性固形物含量呈现显著差异‘魁绿’最高，‘宝贝星’最低。干物质含量方面，三者差别不明显，均较高，在20%左右。

图1 部分猕猴桃材料果实的果皮、果肉颜色Figure 1 Color of peel and pulp of some kiwifruit materials

表3 猕猴桃果实感官评价Table 3 Sensory evaluation of fruits

软枣猕猴桃主要营养成分测定：为进一步评估软枣猕猴桃作为母本的潜力，测定了‘宝贝星’、‘魁绿’、HN- AA - 03067 主要营养成分。结果表明：3种材料的主要营养成分存在不同程度的差异。‘宝贝星’的蛋白质含量显著低于‘魁绿’和HN - AA -03067（P ＜0.05）。HN - AA - 03067 的维生素C 含量高达162mg/100g，是‘宝贝星’的2.44 倍、‘魁绿’的4 倍。糖酸含量及其比例是最关键的营养指标之一，也是影响口感的重要因素。三者相比，‘魁绿’的可溶性糖含量最高而总酸含量最低，7.77 的糖酸比是‘宝贝星’、HN - AA - 03067 的两倍多。说明‘魁绿’口感优于‘宝贝星’和HN - AA - 03067。3 种材料的微量元素含量不尽相同，宝贝星的镁、硒含量较高，‘魁绿’的钙含量较高，而HN- AA-03067 的钾、 钠、铁含量较高（表4）。

表4 软枣猕猴桃主要营养成分Table 4 Main nutrients of kiwiberries

果实耐藏性测试：超过贮藏期的猕猴桃果实，往往表现为斑点直至完全腐烂或失水干缩，失去商品性能。从表5 中的评价结果可见，经过91d 的冷藏后，仅‘金实1 号’未出现斑点或腐烂，‘红实2 号’、‘红阳’和SF201024 显著高于其他受试材料；几种材料几乎没有失水；果实压力反映果实的硬度，压力越小，果实越软。在7 个中华猕猴桃材料中，‘金实1号’最大，显著高于其他材料（P ＜0.05）。综上，耐藏能力排序依次为：‘金实1 号’＞SF - F0814、11E、Hort 16A ＞‘红实2 号’、‘红阳’、SF201024。

表5 果实耐贮性评价Table 5 Storability evaluation of kiwifruits

4 结论与讨论

4.1 结论

本文对具有代表性的42 份中华猕猴桃材料与14份软枣猕猴桃材料的物候期进行了田间调查，测定分析了两大类猕猴桃的染色体倍性和部分材料的果实感官品质、主要营养成分及贮藏性。主要结论如下：①软枣猕猴桃均为四倍体，而中华猕猴桃存在二倍体和四倍体两个倍性小种；②两类猕猴桃的萌芽期、展叶期、花期比较接近，但软枣猕猴桃果实的成熟期和休眠期较中华猕猴桃早；③两类猕猴桃果实在果形、果皮颜色、果肉颜色、单果重、可溶性固形物含量和干物质含量等方面呈现不同程度的差异，中华猕猴桃单果重和可溶性固形物含量均显著高于软枣猕猴桃（P ＜0.05）；④在3 种软枣猕猴桃材料中，HN- AA-03067 的VC含量最高，而‘魁绿’的可溶性糖和糖酸比最高；⑤在耐藏能力方面，‘金实1号’＞SF - F0814、11E、Hort 16A ＞‘红实2 号’、‘红阳’、SF201024。

4.2 讨论

本文测定的42 份中华猕猴桃与14 份软枣猕猴桃不仅有生产上的主栽品种，还有一些潜在利用价值高的种质资源。本文首次公开报道了第二代红肉猕猴桃‘红实2 号’为二倍体，极耐贮藏黄肉品种‘金实1 号’和红肉软枣猕猴桃‘宝贝星’为四倍体，为今后开发利用这些猕猴桃优良品种奠定了一定的遗传基础。本研究还表明，中华猕猴桃与软枣猕猴桃存在着一定程度的物候期差异，意味着如果两类猕猴桃杂交可以获得采收期不同的后代。另外，本文较系统地比较了两类猕猴桃的果实感官品质，同时比较分析了3 份软枣猕猴桃资源的营养成分差异，为中华猕猴桃与软枣猕猴桃种间杂交亲本的选择提供了科学依据，也为同行开发利用受试品种提供了参考。

猕猴桃作为雌雄异株植物，母本评价相对容易，但由于雄株不结实，对雄株的评价难以全面及时。因此，优良雄株父本还需要根据花粉活力测试、直感效应及后代系统性评价等综合确定。