HPLC测定复方氨酚葡锌片中的有关物质对氨基酚的含量

刘凯双，闫 研，殷 果，王铁杰*

（1. 深圳市药品检验研究院，广东 深圳 518057；2. 深圳药品质量标准研究重点实验室，广东 深圳 518057）

复方氨酚葡锌片是由对乙酰氨基酚、葡萄糖酸锌、盐酸二氧丙嗪和板蓝根浸膏粉组成的中西药结合的复方制剂，具有解热、镇痛、镇咳、祛痰、平喘和抗病毒作用[1]。目前国内共有3家生产企业，现行标准为3个国家药品标准[2-4]，国内外药典均未收载。经查询《中国药典》2020年版二部[5]对乙酰氨基酚及其相关制剂标准，均有对氨基酚的检查项。本品含有对乙酰氨基酚，但现行标准均未对其特征物质对氨基酚进行控制。查询文献[6-8]发现目前缺少中西药复方制剂中西药有关物质检测的相关研究。复方氨酚葡锌片为典型的中西药结合复方制剂，由1个中药浸膏成分和3个西药成分组成，为了更好控制复方氨酚葡锌片质量，彻底去除中药浸膏成分对对氨基酚检测结果的干扰，前处理采用乙醇提取、流动相稀释的方法，检测采用HPLC检测对氨基酚。本方法经方法学验证，回收率、准确度良好，且专属性强，灵敏度高，为复方氨酚葡锌片质量标准的提高提供依据，也为中西药复方制剂中有关物质研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Ultimate 3000高效液相色谱仪（DAD3000检测器，德国赛默飞）；XS105DU型电子天平。

1.2 试药

复方氨酚葡锌片（成人规格处方为对乙酰氨基酚100.0 mg，葡萄糖酸锌70.0 mg，盐酸二氧丙嗪1.0 mg，板蓝根浸膏粉250 mg；儿童规格处方为对乙酰氨基酚30.0 mg，葡萄糖酸锌21.0 mg，盐酸二氧丙嗪0.3 mg，板蓝根浸膏粉75 mg，均由河北恒利集团制药股份有限公司提供），原辅料（由河北恒利集团制药股份有限公司提供），对氨基酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100802-201604，含量：100 %），对乙酰氨基酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100018-201610，含量：99.9 %）。乙醇、甲醇（色谱纯，Merck公司），超纯水，醋酸铵为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Waters XBridge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为0.05 mol/L醋酸铵溶液-甲醇（97:3）；流速1.0 ml/min；检测波长230 nm；柱温30 ℃；进样量10 μl，按外标法以峰面积计算。理论板数按对乙酰氨基酚峰计算应不低于5 000，对氨基酚和对乙酰氨基酚峰的分离度应符合要求。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合对照品溶液 取对氨基酚对照品10 mg和对乙酰氨基酚对照品25 mg，精密称定，置入100 ml量瓶，加无水乙醇适量，振摇使对氨基酚和对乙酰氨基酚溶解，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液1 ml，置入5 ml量瓶，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取上述溶液1 ml，置入10 ml量瓶，加流动相稀释制成每1 ml中分别约含对氨基酚2 μg和对乙酰氨基酚5 μg的混合溶液。

2.2.2 供试品溶液 取复方氨酚葡锌片20片（儿童规格30片），精密称定，研细，取本品细粉适量（约相当于对乙酰氨基酚100 mg），精密称定，置入5 ml量瓶，加无水乙醇适量，振摇使对乙酰氨基酚溶解，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液。精密量取上述续滤液1 ml，置入10 ml量瓶，加流动相稀释制成每1 ml中约含对乙酰氨基酚2 mg的溶液。

2.2.3 阴性对照溶液 分别按成人规格和儿童规格处方和说明书，称取除对乙酰氨基酚外的其他主药、辅料和包衣剂，置入5 ml量瓶，按2.2.2项方法，分别配制阴性对照溶液（1）和阴性对照溶液（2）。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性与专属性试验 分别精密吸取2.2项下制得的混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μl，按上述方法和色谱条件测定，记录色谱图，结果见图1。

图1 高效液相色谱图

混合对照品溶液色谱图中各色谱峰峰形良好，对氨基酚和对乙酰氨基酚之间的分离度为33.39，理论板数按照对乙酰氨基酚峰计算为19304，均符合要求（图1，B）。

供试品溶液色谱图中在与对照品溶液色谱图中相应位置，未检测出对氨基酚峰，只检测出对乙酰氨基酚峰。提取方法和检测方法可完全去除中药成分板蓝根浸膏峰的干扰，基线较平，对氨基酚峰的保留时间可延长至6 min，不受溶剂峰干扰，且与对乙酰氨基酚峰之间分离度较好（图1，C～D）。阴性对照溶液（1）和阴性对照溶液（2）在两种主成分相应位置处均无色谱峰出现，表明空白辅料和其他主成分对主峰无干扰（图1，E～F）。

2.3.2 线性试验 精密量取对氨基酚对照品的无水乙醇溶液（20 μg/ml）0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 ml，分别置入10 ml量瓶，用流动相稀释至刻度，摇匀，制成每1 ml含对氨基酚0.8，1.2，1.6，2.0，2.4，2.8 μg的对照品溶液。

分别精密吸取上述各浓度对照品溶液10 μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以对氨基酚浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得到的线性回归方程（n=6）为：A=0.5852C+0.0020，r=0.9998。结果表明，对氨基酚在0.8～2.8 μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系。

2.3.3 精密度试验 精密量取线性试验项下对氨基酚对照品溶液（2.0 μg/ml）10 μl，连续进样6次，记录对氨基酚峰峰面积，对氨基酚峰峰面积RSD为0.87 %（n=6），结果表明仪器精密度良好。

2.3.4 检测限和定量限 取2.3.2项中2.0 μg/ml的对氨基酚对照品溶液，用流动相逐级稀释，按上述色谱条件进样10 μl，以信噪比为3:1时测得对氨基酚的最低检测浓度为0.05 μg/ml，即最低检测限为0.05 μg；以信噪比为10:1时测得对氨基酚的定量检测浓度为0.20 μg/ml，即定量限为0.20 μg。

2.3.5 回收率试验 精密称取样品细粉适量（成人规格、儿童规格）（相当于对乙酰氨基酚100 mg）共9份，分为3组，分别置入5 ml量瓶，每组加入0.1 mg/ml的对氨基酚对照品溶液0.8，1，1.2 ml（各3份），用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，过滤。分别精密量取上述溶液各1 ml，置入10 ml量瓶，用流动相稀释至刻度，分别制得对氨基酚浓度为1.6，2.0，2.4 μg/ml的3组加标溶液。取上述加标溶液，按2.2项色谱条件测定含量，记录色谱，计算回收率，结果见表1～2。

表1 回收率试验结果（n=9）（成人规格）

表2 回收率试验结果（n=9）（儿童规格）

2.3.6 耐用性试验 取含对氨基酚2.0 μg/ml成人规格的和儿童规格的供试品加标溶液，另取两根250 mm（4.6 mm×250 mm，5 μm）的色谱柱（Phenomenex Kinetex C18、Agilent ZORBAX SBAq C18）和两根150 mm（4.6 mm×250 mm，5 μm）的色谱柱（Phenomenex Luna C18、Waters SunFire C18），分别精密吸取供试品加标溶液和对照品溶液各10 μl按2.2项下色谱条件测定。

在更换色谱柱后，对氨基酚峰的保留时间变化范围较大，约4.763～7.817 min。在不同色谱柱上，仅对流动相组成比例（分别考察95:5和98:2两个比例）与柱温（分别考察25和35 ℃）稍作调整，对氨基酚峰均可与其他峰分离良好（分离度＞1.5），分离效果、理论板数均符合要求，表明系统耐用性较好。供试品加标溶液色谱图见图2～3。

图2 供试品加标溶液色谱图（成人规格）

图3 供试品加标溶液色谱图（儿童规格）

2.4 样品含量测定

取成人规格2批和儿童规格1批的的复方氨酚葡锌片，依法制备供试品溶液。精密量取各溶液10 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算对氨基酚的含量。结果见表3。

表3 样品含量测定结果（n=2）

3 讨论

3.1 流动相的选择和干扰峰溯源

本研究分别考察了《中国药典》2020年版二部[5]对乙酰氨基酚有关物质检测项及其相关制剂标准中对氨基酚检查项下的色谱条件，经调整流动相比例发现，以0.05 mol/ml醋酸铵溶液-甲醇（97:3）为流动相和溶剂时对氨基酚色谱峰分离较好，对氨基酚峰的出峰时间可延长至6 min（图4），但对氨基酚峰受其他峰干扰严重，达不到基线分离，经干扰峰溯源发现，干扰峰均来自复方氨酚葡锌片处方成分之一板蓝根浸膏粉（图5）。

图4 对氨基酚对照品（A）和供试品溶液（B）色谱图（以流动相为溶剂）

图5 板蓝根浸膏溶液色谱图（以流动相为溶剂）

3.2 检测波长的选择

本研究使用紫外分光光度法对对氨基酚对照品溶液在190～600 nm波长范围内进行扫描。结果表明，对氨基酚在230nm处有较好的吸收，故选择230 nm作为检测波长。

3.3 提取溶剂的选择

复方氨酚葡锌片是由1个中药浸膏成分和3种西药成分共同组成的复方制剂，由于中药成分的复杂性，且处方中板蓝根浸膏占比较大，对氨基酚是对乙酰氨基酚的特殊杂质，含量较低，上述问题给对氨基酚的检出带来较大困难。实验表明，主要干扰来源于板蓝根浸膏（图5），为了去除板蓝根浸膏的干扰，查询板蓝根浸膏的制备工艺可知，板蓝根浸膏是采用“水提醇沉（60 %乙醇）”法制备。本研究尝试用60 %乙醇和无水乙醇作为提取溶剂，结果表明，以无水乙醇为提取溶剂时，可完全去除板蓝根浸膏的干扰（图1，C～D）。

3.4 样品制备方法和进样体积的选择[9-10]

以无水乙醇作为提取溶剂，可完全去除板蓝根浸膏的干扰，但对氨基酚对照品峰由于溶剂作用，出现肩缝。当以流动相作为对氨基酚对照品的溶剂时，对氨基酚峰峰形良好，故采用先用无水乙醇提取以去除其他峰的干扰，再用流动相稀释的方法制备对照品溶液和供试品溶液。经考察，用无水乙醇提取后，再用流动相稀释时，将对照品溶液和供试品溶液中的乙醇浓度控制在10 %以下，进样量为10 μl时，不仅可以去除供试品中板蓝根浸膏峰的干扰（图1，C～D），同时也可使对氨基酚峰峰形良好（图6A，图7A）。

图6 不同乙醇终浓度对氨基酚对照品溶液色谱图（A：10 %，B：20 %）

图7 不同进样体积对氨基酚对照品溶液色谱图（A：10 μl，B：20 μl）

4 小结

综上所述，本研究建立的复方氨酚葡锌片中有关物质对氨基酚的HPLC检查法，经方法学验证，本法具有前处理简便、快捷、方法准确的特点，且灵敏度高，适用于复方氨酚葡锌片中对氨基酚检测，有利于复方氨酚葡锌片的质量控制。