复方黄柏口腔护理液体外抑菌及刺激性评价研究

许庆友，徐凤霞，任松鹏，韩德凤，李 连，臧恒昌

（1. 山东大学药学院，山东 济南 250012；2. 山东汉方制药有限公司，山东 济南 250000；3. 国家药品监督管理局药物制剂技术研究与评价重点实验室，山东 济南 250012）

口腔健康是全身健康的重要组成部分，口腔微生物菌群及自身免疫失调是导致口腔疾病乃至全身疾病的重要原因[1-2]。对于治疗口腔疾病，有临床研究发现，抗菌药物联合辩证清热解毒药物的中西医结合疗法，可显著提高机体免疫和治疗效果[3]。

复方黄柏液涂剂为已上市中成药，由连翘、黄柏、金银花、蒲公英、蜈蚣配伍，经水提醇沉工艺制备而成，无添加任何抑菌防腐剂；清热解毒，消肿祛腐，用于疮疡溃后，伤口感染，属阳证者；治疗范围从体表皮肤损伤至内脏腔道黏膜损伤，具有较高的临床应用价值。现代药理学研究表明，复方黄柏液涂剂具有抑菌、消炎、促愈合、增强局部非特异性免疫的作用[4-7]。口腔科应用方面亦有治疗口疮、口腔黏膜炎等临床报道[8-9]。但复方黄柏液涂剂用于治疗口腔疾病时，口味较苦，患者往往难以接受。本研究在复方黄柏液涂剂处方工艺基础上，配伍薄荷脑和抗抑菌成分的葡萄糖酸氯己定，并加入适量甜菊糖苷、食用香精矫味，制备成复方黄柏口腔护理液，并实验观察其抑菌作用和黏膜刺激性。

1 材料

1.1 原辅料

连翘（批号：191127）、黄柏（批号：1908061）、金银花（批号：191108）、蒲公英（批号：190911）、蜈蚣（批号：201023）由山东汉方制药有限公司提供，符合中国药典质量要求。

20 %葡萄糖酸氯己定（批号：190304，锦州九泰药业有限公司）；吐温80（批号：20190628），丙二醇（批号：20181116，国药集团化学试剂有限公司）；薄荷脑（批号：X190508，黄山天目薄荷药业有限公司）；甜菊糖苷（批号：20190906，曲阜圣仁制药有限公司）。

1.2 菌株

金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、大肠杆菌（ATCC 8099），取其第9代新鲜斜面培养物进行试验；白色念珠菌（ATCC 10231），取其第7代新鲜斜面培养物进行试验，由广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心提供。

1.3 实验动物

普通级新西兰兔3只，雄性。合格证号：No.1108222011000319，由山东省济南西岭角养殖繁育中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（鲁）2015 0001。

2 方法

2.1 口腔护理液制备

取连翘、黄柏、金银花、蒲公英、蜈蚣，以上五味，加水煎煮3次，第一次1 h，第二次45 min，第三次30 min，合并煎液；滤过，滤液浓缩至相对密度为1.10～1.15（50 ℃）的清膏，加乙醇使含醇量达70 %，静置24 h，滤过，滤液减压浓缩至无醇味，加水至100 ml，搅匀，静置，冷藏24 h，滤过，依次搅拌加入吐温80适量、20 %葡萄糖酸氯己定溶液2.5 g、薄荷脑丙二醇溶液适量、甜菊糖苷适量，食用香精适量，混匀，加水调节至1000 ml，即得。

2.2 抑菌试验[10]

2.2.1 制备抑菌片 取灭菌并干燥的直径为5 mm的新华1号定性滤纸片。每片滴加2.1项制备的口腔护理溶液 20 μl，将滤纸片铺于无菌平皿内，半密封状态置干燥箱（37 ℃）中烘干，备用。

2.2.2 制备阴性对照样片 同2.2.1项，取灭菌处理并且干燥后的滤纸片，每张滤纸片上滴加无菌蒸馏水20 μl，干燥后备用。

2.2.3 接种试验菌 用涂布工具，酒精灯火焰灭菌并冷却后，蘸取浓度为5×105～5×106cfu/ml 试验菌悬液，在营养琼脂培养基平板表面均匀涂布。盖好平皿，室温下干燥5 min。

2.2.4 抑菌剂样片贴放 用无菌镊子取样片贴放于平板表面。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。每个平皿贴放5张样片，其中4张抑菌片、1张阴性对照样片，使各样片中心之间相距25 mm以上，与平板的周缘相距 15 mm 以上，盖好平皿，置37 ℃恒温培养箱中，培养16～18 h 观察结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径（包括贴片）并记录。试验重复3次。

2.2.5 评价规定 抑菌环直径大于7 mm者，判为有抑菌作用。抑菌环直径小于或等于7 mm者，判为无抑菌作用。3 次重复试验均有抑菌作用结果者，判为合格。阴性对照组应无抑菌环产生。否则试验无效。

2.3 急性眼刺激试验[10]

参照《消毒产品卫生安全评价规定》，用于黏膜的抗（抑）菌制剂应当进行眼刺激性试验[11]。

2.3.1 实验动物准备 试验前24 h内检查每只新西兰兔的双眼是否有异常现象，发现有异常现象则淘汰。

2.3.2 染毒方法 采用同体左右侧自身对比法，取受试物原液0.1 ml滴入左侧眼结膜囊内，将眼睛被动闭合4 s，30 s后用氯化钠注射液冲洗。右侧眼睛同法给予氯化钠注射液0.1 ml作为阴性对照组。

2.3.3 结果记录 滴受试物后，将眼被动闭合4 s，30 s后用生理盐水冲洗。分别在24，48，72 h肉眼观察新西兰兔眼结膜、虹膜和角膜的损伤与恢复情况并记录。如有刺激反应情况下，可继续观察记录7，14和21 d情况；如果72 h内未出现刺激反应，或第7天或第14天，眼睛刺激反应完全恢复，即可提前终止试验。

2.3.4 评价规定 按《消毒技术规范》（2002年版）表2-13对家兔眼角膜、虹膜和结膜的急性刺激反应进行评分，并分别计算每只动物在3个不同观察时间（24，48和72 h）角膜损害、虹膜损害、结膜充血和结膜水肿四方面的“平均评分”。分别以动物眼角膜、虹膜和结膜充血、水肿的平均评分和恢复时间进行，按《消毒技术规范》（2002年版）表2-14、表2-15眼刺激反应分级标准判定受试物对眼睛的刺激强度。

3 结果

3.1 抑菌试验

口腔护理液原液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的抑菌环数据分别见表1～表3。

表1 样品原液对金黄色葡萄球菌的抑菌环直径

表2 样品原液对大肠杆菌的抑菌环直径

表3 样品原液对白色念珠菌的抑菌环直径

由表1～表3可见，依据《消毒技术规范》（2002 年版），在试验条件下，由口腔护理液原液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的平均抑菌环直径可见，口腔护理液原液对上述3个菌种均有抑菌作用，符合《消毒技术规范》（2002年版）标准要求。抑菌作用金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌＞白色念珠菌。

3.2 急性眼刺激试验

口腔护理液原液对受试物角膜损害、虹膜损害、结膜充血和结膜水肿情况见表4。

表4 急性眼刺激试验评分结果

由表4可见，本实验条件下，该样品原液对新西兰兔眼刺激的损伤类型为无刺激性，符合《消毒技术规范》（2002年版）的要求。

4 讨论

基于复方黄柏液涂剂对于阳证型黏膜损伤广泛而良好的临床应用反馈，以及口腔部位常见疾病特点，复方黄柏口腔护理液组方最终选择以葡萄糖酸氯己定为抑菌防腐剂。因葡萄糖酸氯己定有长效广谱抑菌作用，可显著抑制致龋菌生长、抗菌斑形成[12]，同时对于破损皮肤刺激性较低，安全性高[13]；常用于牙龈炎、冠周炎、口腔黏膜炎等引致的牙龈出血、牙周脓肿、口腔黏膜溃疡等辅助治疗。本组方中薄荷脑作为清凉矫味剂、促透剂，同时也有疏风清热功效[14]，以协同增强连翘、黄柏、金银花、蒲公英、蜈蚣组合的清热解毒效力。

至于新配方制备的复方黄柏口腔护理液在护理治疗包括口腔溃疡、牙龈肿痛等在内的阳证型口腔疾病疗效上，与复方黄柏液涂剂相比是否提高，有待进一步临床验证。