正交试验设计优选芪参还五胶囊的制备工艺

王世信，杨美娜，崔友祥，丁洪青

（1. 河北省沧州中西医结合医院 中药药学部，河北 沧州 061001；2. 河北省沧州中西医结合医院 脑病三科，河北 沧州 061001）

芪参还五胶囊是由经典方剂补阳还五汤发展而来，是中药复方制剂，有清热养阴、息风化痰、祛瘀通络、补气活血功效[1-2]。临床常用于治疗身疲乏力、头痛半身不遂、胸痹、头晕、中风、胸痛、胸闷、眩晕等[3]。传统的汤剂携带困难，患者服用的顺应性较差且易变质[4]，因此将汤剂制成胶囊剂更方便患者使用[5]。经过研究总结，黄芪、桃仁、红花、当归等药物的有效成分在水中均有较好的溶解度，选择水煎提取法；黄芪和赤芍为主药，故选择毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芍药苷作为主要评价指标[6-7]。应用L9（34）正交实验对芪参还五胶囊的提取工艺进行优化，为该制剂的制备选择合理的提取工艺，为该制剂的大规模生产提供参考。

1 材料与仪器

黄芪、桃仁、红花、当归、赤芍、川芎、玄参、石决明、钩藤、麦冬、连翘、地龙（甘肃安泰堂医药有限公司），经沧州市药品检验所鉴定合格。芍药苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（天津一方科技有限公司）。甲醇、乙腈均为色谱纯，其余相关试剂为分析纯。高效液相色谱仪（SmMADZU LC.15C）；色谱柱[依利特Hypersil ODS2 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]；电子分析天平（AGl35）及各种常规仪器。

2 方法与结果

2.1 实验设计

按照处方量，称取黄芪、桃仁、红花、当归、赤芍、川芎、玄参、石决明、钩藤、麦冬、连翘、地龙，共9份。选择加水倍数、提取时间和提取次数作为主要考察因素，每个因素考察3个水平，进行正交试验，以干膏得率作为主要的评价指标。考察因素见表1。

表1 提取条件正交试验因素水平表

2.2 样品测定方法学

2.2.1 高效液相法条件 色谱柱：依利特Hypersil ODS2 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1 %磷酸水溶液（B）（21:79）；柱温：30 ℃，流速：1 ml/min，波长230～260 nm；进样量：10 μl，分析时间为80 min。

2.2.2 对照品溶液制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芍药苷对照品各适量，精密称定，加甲醇制成毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芍药苷的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液制备 取芪参还五胶囊内容物约5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加甲醇50 ml，称定质量，放置过夜，50 ℃超声处理 1 h，放冷，滤过，滤液浓缩至干，用甲醇溶解并定容至5 ml，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性样品溶液的制备 按本品的处方比例参照最优制备工艺，配制不含赤芍、黄芪的阴性样品，按2.2.3项方法制备阴性对照液。

2.2.5 线性关系考察 分别取对照品溶液1，2，3，4，5，6 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀配制成浓度分别为30，60，90，120，150，180 μg/ml溶液，分别精密吸取10 μl，注入液相色谱仪，按2.2.1项色谱条件，分别测定芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的峰面积，以对照品进样量（x/μg）为横坐标，峰面积积分值（y）为纵坐标，求得芍药苷回归方程，y=5×106x＋11086，r=0.9998，线性范围为30～180 μg/ml；求得毛蕊异黄酮葡萄糖苷回归方程，y=4.32×106x＋9823，r=0.9996，线性范围为30～180 μg/ml。

2.2.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，按2.2.1项色谱条件，测定6次，记录峰面积，计算芍药苷的相对标准偏差为0.23 %，毛蕊异黄酮葡萄糖苷的相对标准偏差为1.21 %，均符合要求。

2.2.7 稳定性试验 精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μl，于0，2，4，8，12，24 h注入液相色谱仪，按2.2.1项色谱条件，记录峰面积，计算芍药苷的相对标准偏差为0.42 %，毛蕊异黄酮葡萄糖苷的相对标准偏差为0.89 %，均符合要求。

2.2.8 重复性试验 精密称取芪参还五胶囊内容物，按供试品制备方法制备6份样品供试品溶液，按2.2.1项色谱条件，计算峰面积。计算芍药苷的相对标准偏差为1.05 %，毛蕊异黄酮葡萄糖苷的相对标准偏差为0.84 %，均符合要求。

2.2.9 加样回收试验 精密称取芪参还五胶囊内容物6份，精密加入一定量的毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芍药苷对照品溶液，制成供试品溶液。采用加样回收率试验，取同一批样品设高、中、低3个浓度，每个浓度平行3份，各浓度水平加入对照品的量与所取供试品含量之比分别为1:1.5，1:1，1:0.5，测定峰面积。计算芍药苷的回收率为98.49 %，RSD为0.52 %，毛蕊异黄酮葡萄糖苷的回收率为101.16 %，RSD为0.79 %，均符合要求。

2.2.10 样品的测定 将各实验收集的溶液进行水浴蒸干，并将残渣置于105 ℃烘箱干燥。精密称取正交实验各实验所得到的干膏重量，计算干膏率；并精密称取各样品适量，参考2.2.3项的方法对样品进行处理，过0.22 μm微孔滤膜，取10 μl滤液进样分析，结果见表2。对所得结果进行方差分析，结果见表3。

表2 正交实验表

表3 两药含量方差分析

当以毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芍药苷作为主要评价指标时，通过极差分析，对毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芍药苷含量的主要影响因素为提取次数，其次为提取时间和加水量；方差分析结果表明，提取次数是对提取工艺影响最大的影响因素；通过对数值大小进行直观比较，A2B3C2为最佳提取工艺。

当以干膏率作为主要评价指标时，通过极差分析，主要影响因素为提取次数，其次为提取时间和加水量；方差分析表明，提取次数是影响提取工艺的主要因素，通过对干膏率进行数据直观分析，最佳提取工艺为A3B3C2。

对结果进行综合考虑，为了节约工时和成本，并达到最大的有效成分提取率和干膏率，最终选择最佳工艺为A2B3C3，即加入药材10倍的水，每次提取2 h，共提取3次。

2.3 实验验证

按照处方量称取药物3份，按照选取的最佳提取工艺进行提取，3次获得的干膏率分别为44.12 %，45.39 %和44.29 %，芍药苷的含量分别为185.32，178.29和182.31 μg/g，毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量分别为163.93，158.28和159.37 μg/g，RSD值分别为1.54 %，1.93 %和1.87 %（n=3）。结果表明，应用正交实验对芪参还五胶囊的制备工艺进行筛选，得到干膏率、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芍药苷含量较高的制备方法。该工艺稳定可行、科学合理可以用于大生产。

3 讨论

补阳还五汤出自清代医家王清任之书写的《医林改错》，处方主要由四两生黄芪、二钱当归尾、一钱半赤芍、一钱地龙、一钱川芎、一钱红花和一钱桃仁组成[8]，是体现益气活血治法的代表药方，常用于治疗中风后遗症[9-10]。本处方临床疗效较好[11]，主要用于治疗中风，患者的常见证状为舌暗苔白脉缓、遗尿不禁、小便频数、口角流涎、语言謇涩、口眼歪斜、肢体麻木和半身不遂[12-13]。具有补气、通络、活血的功效，主要通过大补元气，辅助以活血通络。

芪参还五胶囊[14]药物成分的固体颗粒形式，大大方便储存和运输；颗粒制剂药物含水量少，药物不易腐败变质，增加了药物的储存时间，患者可一次获得多日剂量；胶囊形式也较好地提升了患者的顺应性。

本文对本处方进行HPLC方法验证，结果表明，色谱峰形较好，分离度足够，且线性、精密度、稳定性、加样回收率等项目均符合要求，表明此法能对毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芍药苷进行很好的定性和定量分析。对制备芪参还五胶囊的工艺进行优化，结果表明，该提取工艺所得产品的毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芍药苷含量较高，所得干膏的量较多，且实验重复性较好，为芪参还五胶囊的进一步研究提供了技术支持。