基于p38MAPK信号通路探讨中医药防治脑缺血再灌注损伤

张奎明， 葛鸾蝶， 张林悦， 侯露阳， 马瑞红， 崔应麟

（1.河南中医药大学，河南郑州 450002；2.上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032；3.河南省中医院，河南郑州 450002）

缺血性脑卒中是指因脑供血动脉严重狭窄或急性闭塞，导致局部脑组织缺血、缺氧性坏死，该病具有高患病率、高致残率、高致死率的特点[1]。血管再通疗法虽能恢复血供、消除有毒代谢物，但亦会加重神经功能缺损，这种病理过程被称为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemiareperfusion injury，CIRI）。其损伤机制与炎症、氧化应激、线粒体损伤、细胞内钙超载、谷氨酸兴奋毒性、细胞凋亡有关[2]，这些病理改变可加剧神经炎症，促进小胶质细胞激活，释放多种促炎介质如细胞黏附因子及趋化因子，参与血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）通透性的改变，导致水肿、细胞凋亡或细胞坏死。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一类分化保守的丝氨酸、苏氨酸丝裂原活化蛋白激酶。由MAPK激酶激酶（MAPKKK）、MAPK 激酶（MAPKK）、MAPK 等三级酶联机制相关的细胞外信号和细胞内生化反应，可参与细胞的多种病理生理机制[3]。p38MAPK作为MAPK家族成员，可调控细胞核内基因表达，在细胞炎症、氧化应激、凋亡等生物学过程中发挥重要作用。p38MAPKα 和p38MAPKβ 在神经退行性病变动物模型中可被激活，其中p38MAPKβ 主要存在于星形胶质细胞，p38MAPKα 主要在小胶质细胞表达[4]。p38MAPK 通路与CIRI 病理改变密切相关，以下就其关系进行探讨，以期为中医药防治CIRI提供理论依据。

1 p38MAPK对CIRI的作用机制

1.1 促进炎症反应脑缺血后，脑组织所需的氧和葡萄糖减少，三磷酸腺苷（ATP）合成不足，离子失衡，细胞膜去极化，Ca2+通道激活，兴奋性谷氨酸的释放加速Ca2+内流，导致氨基酸毒性及钙超载，诱发炎症及细胞凋亡，形成以细胞坏死为核心的梗死区及细胞损伤为主的缺血半暗带[5]。脑缺血初期，局部梗死区域释放大量损伤蛋白，激活炎症反应，导致小胶质细胞及星形胶质细胞活化，趋化因子及炎性细胞介质释放。此外，脑组织损伤促进炎性因子如白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）及白细胞介素6（IL-6）等的表达。以上炎性因子在缺血后释放，改变血脑屏障通透性，外周免疫细胞因血脑屏障的通透性增加而富集于病灶，病灶组织的免疫表型暴露，与淋巴细胞发生免疫反应，形成免疫损伤，最终导致脑组织坏死[6-7]。

p38MAPK 作为应激诱导激酶，可调控炎症因子的表达与释放。研究[8]表明，CIRI模型组大鼠脑组织磷酸化p38MAPK 显著增多，而山楂叶总黄酮可拮抗p38活化，抑制下游炎症反应，减少炎症因子的释放，从而减轻脑组织损伤。在CIRI 模型中，p38α 下游靶点MAPK 激活蛋白激酶2（MAPKactivated protein kinase 2，MK2）基因剔除小鼠脑组织中IL-1β、TNF-α的含量明显低于对照组，而MK2 是p38MAPK 调控炎性细胞因子表达的关键下游激酶[9]。亦有研究[10]证实，CIRI 损伤可增加p38MAPK 磷酸化水平，促进其内源性抑制剂的降解，且与脑中IL-1β、TNF-α 和IL-6 水平的下调相一致。Srivastava A 等[11]研究脂多糖诱导的炎症小鼠模型，结果显示，相较于对照组小鼠，丝裂原活化蛋白激酶MKK3 基因缺陷组小鼠磷酸化p38MAPK 及促炎因子表达水平明显降低、抗炎细胞因子IL-10 显著升高，说明MKK3 是p38MAPK活化的重要上游激酶。p38MAPK 已被确定为神经炎症信号通路中的特异性标记，在CIRI 炎症免疫应答中发挥重要作用[12]。

1.2 抑制氧化应激生理条件下，低水平活性氧簇（ROS）在细胞生命活动中充当信号分子；病理状态下，内源性抗氧化机制无法清除过量ROS，高水平ROS 通过氧化核酸、蛋白质、脂质及细胞器，改变其结构而损伤细胞[13]。

神经元具有高耗氧性。缺氧可导致细胞功能障碍、氧自由基过度生成，而大脑富含磷脂，与ROS 发生化学反应可产生过氧化氢自由基，使膜脂质过氧化而损伤细胞[14]。陈松[15]研究电针预处理心肌缺血再灌注大鼠模型发现，与模型组比较，电针预处理组大鼠心肌组织中ROS、丙二醛、超氧化物歧化酶、p38、丝裂原活化蛋白激酶MKK3及MKK6 表达显著降低，而经p38MAPK 通路阻滞剂SB203580 预处理大鼠的丙二醛、超氧化物歧化酶及p38MAPK 表达无明显差异，MKK3 及MKK6表达则降低，提示p38MAPK 信号通路参与氧化应激过程。实验研究表明，黄酮类化合物通过抑制磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）的表达而激活Nrf2通路，促进酶类抗氧化剂的表达[16]。青蒿琥酯对脑缺血再灌注损伤的保护作用可能与调节ROS 的生成有关[17]。

1.3 调控细胞凋亡神经元具有高代谢活性和能量储存有限的特点，对缺血性损伤尤为敏感，因此神经元凋亡是CIRI 的主要病理结果。磷酸化p38MAPK 促进炎性细胞因子释放而触发缺血神经元凋亡级联反应，加重脑组织神经损伤[18]。促凋亡基因Bax 和抗凋亡基因Bcl-2 是调控神经细胞生命进程的关键因素。Bax促进细胞色素C或促凋亡相关因子的释放，触发胱天蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase， caspase）凋 亡 级 联 反 应，caspase-9及caspase-3被激活，可导致细胞凋亡[19]。

p38MAPK 通过激活环磷酸腺苷反应元件结合蛋白，上调Bcl-2 基因表达，而Bcl-2 与Bax 表达比值决定缺血神经元的生命进程，比值上升可阻止Bax活化及移位，从而维持线粒体功能，抑制细胞凋亡，而其比值降低则促使线粒体Bax 同源寡聚，诱发线粒体外膜通道的损伤，继而激活细胞色素C 介导的凋亡级联反应[20]。实验研究[21]表明，阿魏酸通过p38MAPK 通路限制Bax 转位，从而保持线粒体的完整性，发挥脑保护作用。亦有学者研究p38MAPK 信号在游离胆红素孵育的神经元中的激活，结果发现游离胆红素孵育可促进MKK3/MKK6 及p38MAPK 的磷酸化，随后启动核因子κB（NF-κB）的激活、转位，导致神经元凋亡[22]。caspase-3 作为多种凋亡途径的共同下游产物，是细胞凋亡的关键蛋白酶，p38MAPK 作用于caspase-3的上游，活化的caspase-3可裂解基因修复酶、抑制受损基因的修复，加速缺血神经细胞的凋亡[23]。

p38MAPK 在脑缺血再灌注损伤机制中的作用见图1。

图1 p38MAPK在脑缺血再灌注损伤机制中的作用Figure 1 Role of p38MAPK in the mechanism of cerebral ischemia-reperfusion injury

2 基于p38MAPK信号通路探讨中医药防治CIRI的机制

CIRI 可归属于中医学的缺血性中风范畴。其形成机制是在肝肾亏虚、气血不足的基础上，风、火、痰、瘀、虚互相搏结，上逆犯脑，导致脑脉痹阻、气机不通，因而发病。缺血性中风具有起病急骤、变化迅速、中老年多发的特点。《灵枢·刺节真邪》云：“虚邪偏客于身半，其入深，内居荣卫，荣卫稍衰，则真气去，邪气独留，发为偏枯。”指出体虚为中风之始，在此基础上，历代医家加以阐发。金元时期的李杲首次提出气虚为内风之本；清代的王清任集粹百家，博采众长，于《医林改错·半身不遂本源》进一步阐明气虚中风的基础，并在《医林改错·论抽风不是风》中创新性地提出“因虚致瘀，气虚血瘀”理论。津血同源，血瘀津凝，津凝痰生，痰浊血瘀可相互转化、互为因果，终导致“痰瘀同病”。清代叶桂在《临证指南医案·中风》中阐明气虚津停，津停则痰湿内生的机制，认为气虚中风者多兼见痰浊、水湿。由此可见，痰、瘀、虚是缺血性中风的主要证候因素。动脉粥样硬化是缺血性中风的常见原因，临床研究表明大多数CIRI 患者具有动脉粥样硬化病史，磁共振成像显示脑血管斑块性狭窄[24]，这与中医气虚血脉失充，痰瘀阻滞而气失升降的机制相合。因此，缺血性中风的主要病机为气虚血瘀、痰瘀互阻，治疗当以益气活血、通脉祛浊为主。

2.1 益气活血法气虚血瘀为缺血性中风发病的基础。研究表明，益气活血法能有效扩张脑血管，改善脑组织缺血缺氧状态及舌象、脉象、血象指标，促进血管新生蛋白表达[25]。益气通脉方是崔应麟教授根据多年临证经验研制的院内制剂，该方药简力专，疗效显著，以人参、丹参、三七、水蛭、土鳖虫、大黄组成，人参培补元气，气旺脉通，血行瘀化，扶正祛邪，是为君药；丹参活血通经、祛瘀止痛，配伍三七化瘀止血、补虚生新，使瘀去新生、循经有序，是为臣药；水蛭活血通经，配合土鳖虫破血逐瘀，引药入经，循行周身，行中有和，破而不峻，是为佐药；大黄苦寒，泻下降浊，凉血逐瘀，攻守兼备，既可清泻君药之热，亦可通血气、和五脏，推陈致新，是为佐使之药。诸药合用，标本兼治，共奏益气活血、化瘀通络之功。

药理学研究证实，益气通脉方中的部分组成药物可通过p38MAPK 信号通路抑制炎症反应、改善氧化应激、控制细胞凋亡，减轻缺血半暗带损伤[26-27]。人参天然活性成分Rg1 具有神经营养作用，其对CIRI的保护机制，是基于p38MAPK抗氧化应激相关的凋亡效应、抑制炎症免疫刺激的坏死效应和调控神经细胞周期3个方面[28]。丹参可减轻氧化性损伤，改善能量代谢，从而抑制中性粒细胞浸润，减少缺血脑组织p38MAPK 的磷酸化，调控其下游原癌基因的表达，改变凋亡基因caspase-3 介导的凋亡，也能抑制一氧化氮合酶，下调基质金属蛋白酶表达，保护受损血脑屏障[29-30]。三七能抑制p38MAPK上游靶点MAPK14蛋白活化，从而抑制p38MAPK磷酸化，减少ROS含量，增加缺氧复氧细胞内的超氧化物歧化酶表达，降低细胞内丙二醛含量及乳酸脱氢酶漏出，缓解细胞氧化及炎症损伤[31-32]。水蛭提取物通过p38MAPK信号通路调节Bcl-2及Bax蛋白含量，降低脑细胞凋亡率；还能提高血清或脑组织中超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛及一氧化氮含量，减少细胞间黏附分子1、血管细胞黏附分子1 及血小板衍生生长因子等细胞因子的产生，从而减轻CIRI的脑损伤[33-34]。土鳖虫提取液能明显延长脑缺血缺氧小鼠存活时间，增强缺血缺氧小鼠脑组织超氧化物歧化酶活性，提高丙二醛含量，降低一氧化氮合酶活性，减少一氧化氮生成，其脑保护机制与其通过p38MAPK 通路发挥抗氧化作用有关[35]。大黄治疗CIRI 的有效成分为大黄酚，能清除CIRI 产生的大量ROS，有效降低一氧化氮介导的细胞毒性，抑制p38MAPK 的炎症级联反应，减少血栓形成及血小板聚集和黏附，并通过p38MAPK 通路降低Bax 及caspase-3 表达，减轻神经细胞损伤[36-37]。

2.2 温阳通脉法缺血性中风患者颈动脉粥样硬化斑块患病率约为76.9%，可见动脉粥样硬化斑块是缺血性中风的主要危险因素。稳定或消除动脉粥样硬化斑块对防治CIRI 具有重要意义[38]。颈动脉粥样硬化斑块在中医理论中无固定病名，有学者依据其部位命名为“人迎脉积”[39]。中医认为，“人迎脉积”的病机为气虚血瘀。气虚则血滞，滞积则为瘀，瘀血壅滞则血脉不通、气机不利；血瘀则津停，津液失布则结聚成痰，痰为瘀之渐，瘀为痰之果，相互胶着则为痰瘀，痰瘀互阻，胶着沉附而成斑块[40]。临床表现如头痛、头晕、肢体麻木、思维迟钝等可反映动脉硬化负荷程度，预测脑血管梗死状况。崔应麟教授通过大量临床实践，发现痰瘀互阻型颈动脉粥样硬化斑块最为常见，并依据《黄帝内经》“阳化气，阴成型”理论及阴阳升降学说，将颈动脉粥样硬化斑块的发病机制总结为“阳微气弱，痰湿不化；浊阴阻脉，通降失常。”其以“温下通消法”论治，通阳祛浊以复气机升降，化痰散瘀以复血脉通利，创立通脉祛浊散（主要由桂枝、生大黄、生水蛭、生山楂组成）治疗颈动脉粥样硬化性脑缺血，疗效显著[41]。方中桂枝温阳化气、平冲降逆，大黄逐瘀通经、泻下降浊，二药升降互用，攻下而不伤正，共祛浊阴，通达阴阳升降之路；水蛭力专走窜、破血通经，山楂行气散瘀、化浊降脂，二药通消兼施，清化瘀血痰浊。诸药相配，通阳祛浊，消痰散瘀。现代药理研究表明，桂枝具有扩张血管、增加循环血容量、抗凝血、抗血小板聚集的作用，并通过p38MAPK 通路抑制成纤维细胞合成IL-6，降低血管平滑肌细胞增殖能力，从而减少斑块炎症损伤[42-43]。大黄能降低甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白水平，增加乳酸脱氢酶的活性进而减少脂质积累，改善体内生化指标，降低血液黏稠度，改善微循环[44-45]。水蛭中的水蛭素作用于凝血过程的不同靶点，可抑制血小板聚集、组织纤溶途径，发挥抗血栓作用，并能降低p38MAPK 磷酸化水平，抑制巨噬细胞向血管内膜下层迁移，控制脂质条纹、纤维斑块的形成，防治动脉粥样硬化[46-47]。山楂可抑制甘油-3-磷酸酰基转移酶及磷脂酸磷酸水解酶活性，降低血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平，促进胆固醇代谢，其作用机制与p38MAPK 抗氧化活性及抑制炎性因子释放有关[48-49]。

3 讨论与展望

p38MAPK 通过多种途径参与脑缺血再灌注损伤（CIRI）的病理改变，其水平在CIRI 脑组织中明显升高，对脑组织造成二次损伤且证实其抑制剂在脑缺血急性期可保护脑组织免受伤害。但p38MAPK 在CIRI 的确切作用机制尚待深入研究。国内外基础研究多集中于p38MAPK 蛋白，对其上下游靶点关注较少，临床研究尚缺乏大样本支撑且新药开发周期长、作用机制模糊。中医临床注重整体观念与理法方药的统一，中药复方具有多靶点、多功效、全方位的治疗特点，基于p38MAPK 信号通路探讨中医药干预CIRI，可为临床防治缺血性脑卒中的实验研究与临床治疗提供思路。