奖赏行为对小鼠声音性恐惧消退记忆建立和巩固的影响

汪静雯，昂邵佳，金展鑫，仝懿铭，张允春，刘冬播，石 彦

(蚌埠医学院 1.精神卫生学院;2.临床医学院;3.基础医学院人体解剖学教研室;4.第一附属医院超声医学科，安徽 蚌埠 233030)

恐惧情绪所引发的防御性行为反应已经进化到使有机体能够减少或远离伤害性刺激，从而确保其生存。在许多动物种群中都能观察到这种恐惧情绪与行为的关联，这反映了恐惧防御行为在适应潜在危险环境中的重要性。然而，人类中由于过度恐惧所引起的心理性疾病如恐惧症、创伤后应激障碍(Post-traumatic stress disorder,PTSD)等不但严重影响了个人的生活，而且也给整个社会带来沉重的负担[1]。

过去的研究强调了在某些特定大脑区域中神经调节过程对恐惧反应的作用[2-3]，而最近的证据表明，恐惧情绪状态与大脑不同区域内和区域间神经元回路的功能状态相关[4]，并且恐惧与其它种类情绪反应如奖赏反应涉及的大脑区域及神经环路之间表现出部分或者很大的重叠性[5]。目前，对恐惧与其它情绪之间神经环路的分化和趋同的认识及其对临床恐惧相关疾病治疗的指导尚处于初级阶段[6]。本研究在小鼠恐惧消退学习过程中同步施加食物奖赏，从而探寻积极情绪对消极情绪消退的影响，以期为恐惧情绪的产生和消退机制以及由于不适宜的过度恐惧造成的心因性疾病的治疗和痊愈寻找更多的理论依据和支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组选取8周雄性SPF级C57BL/6小鼠22只，体重(23.1±0.6)g，由山东省动物实验中心提供[使用许可证号：SYXK(鲁)2021-0089]。动物施行单笼饲养，保证正常光照周期，温度22～26 ℃，环境噪声<65 dB。采用随机数目表法将小鼠分为对照组和奖赏组，每组11只。实验前每日对小鼠采取捉拿操作，每日2次，每次30 s[7]。本研究所有实验程序及动物管理均得到蚌埠医学院实验动物保护和使用伦理委员会的批准，符合国家《实验动物管理条例》使用指南。

1.2 仪器与设备恐惧实验分析系统(Ugo basile公司)通过视频摄像跟踪技术，实时追踪动物行动轨迹，连续拍摄(25 帧/s)系列图像进行动物微细行为的比对和分辨，自动化记录和分析动物行为指标参数(平均速度、僵立时间占总时间百分比等)。僵立的判断标准为动物在恐惧时表现出特有的不动状态(不动比值为0.005)。恐惧条件反射箱包括箱A和箱B，箱A包括内箱和外箱，内箱为无盖黑色有机塑料，底部为18根铜棒组成的电栅(间距5 mm)，电流误差小于0.04 mA;外箱为隔音箱，侧壁换气装置维持背景噪声，相对侧声音控制器提供条件性声音刺激。箱B外箱同箱A，内箱为无盖白色有机玻璃，底部为白色不透明有机玻璃隔板。小鼠每次入箱前均在内箱喷洒75%浓度的酒精并擦拭以消除前一只小鼠的气味影响。

1.3 声音性恐惧条件反射建立程序两组小鼠均给予此处理。第1天进行自适应，将每只小鼠分别置于恐惧条件反射箱A和箱B中各15 min，熟悉和适应条件反射的建立环境。24 h后(第2天)开始建立声音性恐惧条件反射，首先将小鼠轻置于箱A中，3 min适应阶段后控制器施加持续性声音刺激(80 dB，3000 Hz，20 s)，每次声音结束前5 s通过铜棒对小鼠足底施加电流刺激(0.8 mA，5 s)。每次声音性刺激联合足底电击作为一次条件反射训练，恐惧条件反射建立过程中共进行6次相同训练，相邻训练之间平均间隔150 s，最后一次训练结束后30 s从箱A中轻取出小鼠[8]。

1.4 声音性恐惧条件反射消退和消退记忆再现检测程序恐惧条件反射建立后对小鼠禁食4 h，然后将小鼠轻置放入恐惧条件反射箱B中(第3天)，3 min适应阶段后控制器施加持续性声音刺激(80 dB，3000 Hz，20 s)，不对足底进行电击，同时对每只奖赏组小鼠给予尺寸、颜色和质地相同的饲料，对照组小鼠不给予食物。反射消退过程共施加12次声音刺激，连续两次声音训练时间之和设为一个训练周期，相邻训练之间平均间隔150 s，最后一次训练结束后30 s从箱B中轻取出小鼠。恐惧条件反射消退训练24 h后(第4天)进行消退记忆再现检测，将小鼠轻置放入恐惧条件反射箱B中，仅施加12次持续性声音刺激(80 dB，3000 Hz，20 s)，无奖赏无电击，相邻训练之间平均间隔150 s，最后一次训练结束后30 s从箱B中轻取出小鼠。恐惧条件反射消退训练1周后(第11天)重复消退记忆再现检测程序[8]。

1.5 研究指标平均速度(cm/s)是指一个实验周期内小鼠运动轨迹总长度与运动时间的比值;僵立(Freezing)主要表现为呼吸活动占据主导，整体呈现静止不动的状态。对于每一个实验周期中小鼠僵立状态的判断、僵立时间、僵立时间百分比(单位时间内僵立时间与总时间的百分比值)和平均速度等指标参数主要通过恐惧实验分析系统的视频摄像跟踪技术进行自动化记录和生成。

1.6 统计学方法实验数据通过SPSS 21.0统计软件进行分析，计量资料采用“均数±标准差”形式表示，组间采用两独立样本t检验进行比较和分析，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 声音性恐惧条件反射建立程序中两组小鼠僵立百分比声音性恐惧条件反射建立程序中，第1次训练中两组小鼠处于相同恐惧僵立起点，其僵立百分比之间无明显差异，随后5次训练中，随着声音联合电击刺激的不断施加，两组小鼠僵立百分比逐渐升高，之间无明显差异，见表1。

表1 两组鼠声音性恐惧条件反射建立阶段僵立百分比比较

2.2 声音性恐惧条件反射消退程序中两组小鼠僵立百分比声音性恐惧条件反射消退程序中，第1次训练中两组小鼠具有相同恐惧僵立起点，其僵立百分比之间无明显差异，随后5次训练中，随着声音刺激的不断施加，两组小鼠僵立百分比逐渐降低，第2次训练中两组小鼠僵立百分比之间无明显差异，而第3～6次训练中奖赏组小鼠僵立百分比明显低于对照组(P<0.05;P<0.01)，见表2。

表2 两组小鼠声音性恐惧条件反射消退阶段僵立百分比比较

2.3 声音性恐惧条件反射消退记忆再现程序中两组小鼠僵立百分比声音性恐惧条件反射消退记忆再现检测和重复检测程序中，第1次训练中两组小鼠表现出不同恐惧僵立起点，奖赏组小鼠僵立百分比均明显低于对照组，随后5次训练中，随着声音刺激的不断施加，两组小鼠僵立百分比均逐渐降低，奖赏组小鼠僵立百分比明显低于对照组(P<0.05;P<0.01)，见表3、表4。

表3 两组小鼠声音性恐惧条件反射消退记忆再现检测阶段僵立百分比比较

表4 两组小鼠声音性恐惧条件反射消退记忆再现重复检测阶段僵立百分比比较

2.4 声音性恐惧条件反射各阶段两组小鼠僵立次数比较自适应阶段，两组小鼠僵立次数无明显差异，声音性恐惧条件反射建立程序中，僵立次数明显高于自适应阶段，两组之间无明显差异，声音性恐惧条件反射消退、检测及重复检测程序中，两组小鼠僵立次数整体呈下降趋势，奖赏组小鼠僵立次数均明显低于对照组(P<0.05;P<0.01)，见表5。

表5 两组小鼠声音性恐惧条件反射各阶段僵立次数比较

2.5 声音性恐惧条件反射各阶段两组小鼠平均速度比较自适应阶段，两组小鼠平均速度无明显差异，声音性恐惧条件反射建立程序中，平均速度明显低于自适应阶段，两组之间无明显差异，声音性恐惧条件反射消退、检测及重复检测程序中，两组小鼠平均速度整体呈上升趋势，奖赏组小鼠平均速度均明显高于对照组(P<0.05;P<0.01)，见表6。

表6 两组小鼠声音性恐惧条件反射各阶段平均速度(cm/s)比较

3 讨论

杏仁核、mPFC和海马等脑区相互之间存在的神经环路与恐惧等消极情绪高度相关，与此观点相反，最近的证据指出了这些神经基质在积极情绪中也起着主要作用，甚至与先前关于杏仁核等脑区在奖赏处理中的作用结论相矛盾[9]。对于杏仁核主要作用于消极情绪的观点仍然根深蒂固，这些理论认为杏仁核是一种保护装置，对一切具有潜在性危险的刺激起到“过滤器”的作用，可以防止动物从事潜在的有害行为[10]。在某种程度上，这种观点源于恐惧条件反射作为情绪学习模式的主导作用，这种主导作用将条件性和非条件性环境刺激因素造成的恐惧情绪与相关核团的功能变化紧密联系在一起。神经影像学的早期研究中，也认为杏仁核主要处理负面情绪[11]。然而，许多研究结果也表明了杏仁核在处理积极情感方面的作用，其内部具有与积极强化和消极强化相关的信号通路，这些信号通路作为表征预期强化结果的基础，还可能影响感知和记忆，这意味着积极情感(如奖赏)对消极情感(如恐惧)的消退和消退保持过程、负性情绪相关脑区回路的调节重建以及神经元之间突触联络的可塑性可能产生一定的影响[12]。

由于积极情绪和消极情绪之间存在分化和趋同关系，所以本研究将重点放在由奖赏引起的积极情绪对由恐惧引起的消极情绪消退和消退记忆保持的影响上。实验结果显示，声音性恐惧条件反射建立程序中，两组小鼠僵立百分比逐渐升高，表明随着声音联合电击刺激的不断施加，两组小鼠对此联合刺激方式逐渐习得并最终建立起声音性恐惧条件反射。声音性恐惧条件反射消退程序中，两组小鼠具有相同恐惧僵立起点，随着声音刺激的不断施加，两组小鼠僵立百分比逐渐降低，表明随着与声音匹配电击的去除，小鼠逐渐建立起恐惧消退记忆，而从训练3开始两组小鼠僵立百分比之间出现差异，奖赏组小鼠僵立百分比明显低于对照组，意味着奖励行为提高了小鼠恐惧消退的速度。声音性恐惧条件反射消退检测和重复检测程序中，两组小鼠表现出不同恐惧僵立起点，奖赏组小鼠僵立起点明显低于对照组，随后5次训练中，随着声音刺激的不断施加，两组小鼠僵立百分比均逐渐降低，奖赏组小鼠僵立百分比明显低于对照组，意味着奖励行为提高了小鼠对恐惧消退记忆的巩固能力，这种能力包括了对远期(1周后)恐惧消退记忆的巩固。声音性恐惧条件反射消退、检测及重复检测程序中，两组小鼠僵立次数整体呈下降趋势，奖赏组僵立次数均明显低于对照组，同时平均速度整体呈上升趋势，奖赏组平均速度均明显高于对照组，意味着奖赏行为提高了小鼠声音性恐惧条件反射的消退速度，增强了小鼠对声音性恐惧条件反射消退记忆的学习和保持能力。

经由以上分析，说明奖赏行为可以促进小鼠更快地建立恐惧消退记忆，在恐惧消退记忆检测过程中，先前的奖赏行为提高了消退记忆的进一步加工和储存能力，这种增强的对恐惧消退记忆的巩固能力表现出一定的时间延伸性。众所周知，恐惧习得阶段的典型特征是，当训练中出现多个配对时，条件反应的表达逐渐增加，恐惧记忆会随着时间的推移而得到巩固，它们的提取可以通过在新的环境中单独呈现CS(线索恐惧测试)或再次暴露在条件反射环境中(情境恐惧测试)来诱导和测量。而重复出现CS只会导致条件反应的减少，这反映了一种被称为消退的依赖性学习过程[5]。但是，消退学习不能完全消除条件性恐惧，在消退训练之后，条件性恐惧可能会卷土重来。在许多实验动物中，消退的条件性恐惧反应随着时间的推移或者在一个厌恶的事件之后自发恢复，又或者在一个新的非消退的背景下得到更新，表明消退不是消除最初的记忆痕迹，而是产生了新的学习[12-13]。然而本研究发现，恐惧消退训练结束后1周进行的条件性恐惧检测结果表明小鼠仍然处于恐惧消退阶段，消退的条件性恐惧反应随着时间的推移没有自发恢复，考虑两种可能性，一是时间窗口期不够，需要进一步延长恐惧条件反射重复检测的时间;二是奖赏行为对小鼠恐惧消退起到了一定的影响，不仅体现在对恐惧消退记忆建立和存储能力的提高，而且在恐惧消退记忆的远期巩固过程中显示出对单独呈现CS而不伴有情绪行为和体验这一反射记忆的持续性和稳定性，这可能牵涉到奖赏行为对杏仁核、mPFC和海马等与恐惧情绪相关脑区神经回路的改变和重塑，我们将通过后期延长消退记忆检测时间节点进一步分析和验证。

综上所述，我们发现奖励提高了小鼠声音性恐惧条件反射消退和消退记忆保持的能力，这可能牵涉到消极和积极情绪相关脑区神经回路的重叠性和交互性，以及神经回路中细微结构如突触蛋白、受体等一系列分子层面的可塑性变化。下一步我们将利用神经染色、电生理技术等进一步深入杏仁核、mPFC等脑区，针对性探寻不同区域的亚细胞区在此过程的改变，为在整体上把握奖赏等积极情绪与恐惧等消极情绪相互影响作用的分子机制，阐明杏仁核等脑区之间神经回路和神经基质与情感调节之间的关系提供新的见解。