猪流行性腹泻病毒截短M基因克隆、生物信息学分析及其截短片段表达

张明亮，耿亚春，连凯琪，马 磊，常 莹，王双山，张福良

（1.安阳工学院生物与食品工程学院，安阳 455000;2.河南省兽用生物制品研发与应用国际联合实验室，安阳 455000）

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的猪的高度接触性肠道传染性疾病，其临床症状包括严重腹泻、脱水和呕吐，仔猪死亡率最高，可达90%[1-3]。该病的流行给全球养猪业带来了巨大的经济损失，因此,对该病的诊断和防控具有重大意义[4-6]。1971年，该病在英国首次暴发，之后迅速在欧洲各国发现[7]。1978年成功分离到该病病原体，并命名为PEDV CV777[8]。M蛋白是PEDV重要的结构蛋白之一，也是病毒囊膜蛋白中含量最丰富的蛋白。该蛋白介导了病毒的装配，还能诱导机体产生α-干扰素。因此，PEDV M蛋白被认为是检测和制备基因工程产品的有效候选抗原[9-10]。生物信息学分析在促进建立和完善传染病的诊断试剂、疫苗研制及抗体工程等方面具有重要作用。然而，针对M蛋白的生物信息学分析及蛋白表达的报道很少，本研究克隆了截短的M基因（rM），分析了rM蛋白的结构特征，并对该基因进行原核表达，以期为基于该蛋白检测及预防性生物制品的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料、试验动物、菌种及质粒 表达载体pET-28a（+）、采集于豫北某猪场的PEDV阳性病料（小肠）、PEDV阳性血清及阴性血清均由河南省兽用生物制品研发与应用国际联合实验室保存；6月龄体重约3 kg的雌性新西兰大白兔购自河南信诚有康生物技术有限公司；大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）感受态细胞均购自北京博迈德基因技术有限公司。

1.1.2 主要试剂及仪器 DL15000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker、病毒RNA提取试剂盒、pMD18-T载体、反转录试剂盒、限制性内切酶EcoRⅠ及XhoⅠ均购自TaKaRa公司；质粒小提试剂盒购自莫纳生物科技有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、蛋白质分子质量标准均购自北京全式金生物技术有限公司；弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司；包涵体纯化试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；T4 DNA连接酶购自NEB公司；ECL化学发光显色液、辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗猪二抗均购自Proteintech公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 病料RNA提取 参照病毒RNA提取试剂盒说明书提取病料RNA，利用反转录试剂盒合成cDNA,-80 ℃保存备用。

1.2.2 引物设计及合成 参照GenBank公布的PEDVM基因序列（登录号：NC_003436.1），采用DNAStar软件进行基因的亲/疏水性分析，选取亲水性较好的基因片段，命名为rM，并设计合成特异性引物。 引物序列为：MF：5′-CCGGAATTCATG-ACACATTCTTGGTGGT-3′（下划线处为EcoRⅠ酶切位点）；MR：5′-CCGCTCGAGTTAGACTA-AATGAAGCACT-3′（下划线处为XhoⅠ酶切位点）。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

1.2.3 截短的M基因扩增及鉴定 以得到的cDNA为模板，用引物MF、MR扩增截短的M基因片段。PCR反应体系50 μL：5×PCR Buffer 5 μL，TaqHS 0.25 μL，MF/MR各0.5 μL，cDNA模板8 μL，灭菌去离子水35.75 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，45 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，将得到的截短的M基因连接pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒经双酶切鉴定正确后，命名为pMD18-T-rM，送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

1.2.4 rM蛋白氨基酸序列特征分析 利用生物信息学软件分析rM蛋白氨基酸序列，预测rM蛋白的结构特征，软件信息及功能见表1。

表1 生物信息学软件及网址Table 1 Bioinformatics softwares and websites

1.2.5 重组菌株的构建及鉴定 将测序正确的质粒pMD18-T-rM与原核表达载体pET-28a（+）同时用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，回收酶切片段并连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，小批量提取质粒，经双酶切鉴定正确后，重组质粒命名为pET-28a-rM，将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，将鉴定正确的重组菌株命名为BL21（pET-28a-rM）。 将原核表达载体pET-28a（+）转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，鉴定正确的重组菌株命名为BL21（pET-28a）。

1.2.6 rM蛋白的可溶性检测及诱导表达 挑取重组菌株BL21（pET-28a-rM）和BL21（pET-28a）单菌落接种于5 mL LB培养基（含50 μg/mL卡那霉素），37 ℃、200 r/min恒温摇床培养过夜。取过夜培养菌液按比例1∶100接种于5 mL LB培养基（含50 μg/mL卡那霉素），37 ℃、200 r/min恒温摇床培养，至D600 nm值约为0.6时，分别加入终浓度为0.5、0.8、1.0和1.5 mmol/L的IPTG进行诱导，诱导表达12 h后，取2 mL菌液，12 000 r/min离心后弃上清，PBS 10倍浓缩重悬，分别在重悬菌液中加入适量的5×Loading Buffer，煮沸10 min，SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。待电泳完毕，将胶块置于考马斯亮蓝染色液中染色2 h，将染色后的胶块置于脱色液中脱色；将诱导表达的重组菌BL21（pET-28a-rM）和BL21（pET-28a）分别离心，无菌PBS洗涤2遍，适量PBS重悬沉淀。将重悬菌液置于小烧杯中，并在冰浴中超声破碎，待菌体破碎完全时，取出菌液，12 000 r/min离心10 min，取上清及沉淀，之后用适量PBS重悬沉淀。在重悬液中加入适量的5×Loading Buffer，煮沸10 min，SDS-PAGE检测上清及沉淀中蛋白的表达情况。

1.2.7 rM蛋白的纯化 将诱导表达的BL21（pET-28a-rM）离心，用无菌生理盐水洗涤2遍，量取适量的生理盐水将菌体重悬，将装有重悬菌液的容器置于冰浴中，进行超声破碎，待破碎完全时，取出菌液。12 000 r/min离心10 min，取适量的Binding Buffer溶解沉淀。用0.8 μm滤器过滤沉淀溶解液，将滤液加入平衡好的His标签蛋白纯化镍柱，进行rM蛋白的纯化。待滤液与柱子作用一段时间后，向柱子中加入适量洗脱液洗脱rM蛋白，最后用SDS-PAGE检测纯化后的rM蛋白。

1.2.8 rM蛋白的Western blotting检测 将诱导表达的BL21（pET-28a-rM）和BL21（pET-28a）的蛋白样品转印PVDF膜。结束转膜后，将膜置于封闭液中封闭4 h。以感染PEDV猪的阳性血清为一抗，HRP标记的兔抗猪IgG为二抗，ECL发光液显色、拍照。

1.2.9 rM蛋白多克隆抗体的制备及效价检测 将0.5 mg纯化的rM蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化，背部皮下分点注射免疫新西兰大白兔。分别在14和28 d各加强免疫一次（0.5 mg rM蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化）。在第3次免疫后的1周采集动物血液，分离血清，-20 ℃保存备用。

1.2.10 rM蛋白多克隆抗体效价检测 将准备好的rM抗原用包被液稀释至一定的浓度，加入96孔ELISA板，100 μL/孔，4 ℃包被过夜；PBST洗涤3遍，每次10 min，将封闭液加入96孔ELISA板，200 μL/孔，37 ℃孵育2 h；将待检测样本按照相应稀释度（1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400）加入包被好的相应的96孔ELISA板中，37 ℃孵育45 min；PBST洗涤3遍，每次10 min，加入1∶5 000稀释的HRP标记的兔抗猪二抗，100 μL/孔，37 ℃孵育30 min；PBST洗涤3遍，每次10 min，加入TMB显色液，100 μL/孔，避光显色10 min，加入2 mol/L硫酸终止反应，100 μL/孔，酶标仪检测各孔的D450 nm值。

2 结 果

2.1 截短的M基因扩增及鉴定

以cDNA作为模板进行PCR扩增，结果在约366 bp处观察到目的条带（图1）。截短的M基因与pMD18-T载体连接、转化后，提取质粒，采用XhoⅠ和EcoRⅠ进行酶切，得到大小约2 692和366 bp的条带（图2），与预期结果一致。测序结果表明，克隆序列与GenBank中登录的M基因序列一致，表明成功克隆得到了截短的M基因序列。

M,DL2000 DNA Marker；1～3,截短的M基因；4，阴性对照M,DL2000 DNA Marker;1-3,Truncated M gene;4,Negative control图1 截短的M基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification result of truncated M gene

M1,DL2000 DNA Marker；1,阴性对照；2,双酶切结果；3,截短的M基因；M2,DL15000 DNA MarkerM1,DL2000 DNA Marker;1,Negative control;2,Double enzyme digestion results;3,Truncated M gene;M2,DL15000 DNA Marker图2 质粒pMD18-rM酶切鉴定Fig.2 Double enzyme identification of plasmid pMD18-rM

2.2 rM蛋白理化性质分析

利用ProtParam预测rM蛋白理化性质，结果表明，rM蛋白由121个氨基酸数组成，其分子式为C575H909N153O173S2，分子质量为12.8 ku，该蛋白的理论等电点（pI）为8.89，为碱性蛋白质，氨基酸残基中Ser（10.7%）、Thr（12.4%）频率较高，带负电荷残基（Asp+Glu）总数为6个，正电荷残基（Arg+Lys）总数为8个。 其消光系数为22 460，不稳定指数（Ⅱ）为20.91（<40），属于稳定类蛋白，因为序列的N-端是Thr，估计在体外哺乳动物网织红细胞的半衰期是7.2 h。疏水指数为95.70，总平均疏水性（GRAVY）为0.242，属于疏水类蛋白。 使用ProtScale中的Kyte & Doolittle对rM蛋白的疏水性进行预测（windows size=9），该蛋白序列具有较高的疏水性，在第28位氨基酸处分值最高（1.933），疏水性最强；在第99位氨基酸处分值最低（-1.844），亲水性最强。主要疏水部位分布在第16-18、21-57、59-78、90-92和106-108位氨基酸处，主要亲水性部位分布在第5-14、79-89、93-105和109-112位氨基酸处。因此，综合分析该蛋白为疏水性蛋白。

2.3 rM蛋白结构分析

根据rM氨基酸序列进行保守结构域分析，保守结构域为第1-116位氨基酸。糖基化位点分析显示，rM蛋白无N-糖基化位点和O-糖基化位点。rM共存在21个磷酸化位点，分别为12个Ser、8个Thr和 1个Tyr（图3）。

图3 rM蛋白磷酸化位点分析Fig.3 Analysis of phosphorylation site of rM protein

氨基酸序列分析显示，rM蛋白无信号肽（图4），但有跨膜区（图5）。该蛋白含有4个B细胞线性结合位点和7个T细胞结合位点。生物信息学软件预测结果显示，rM蛋白二级结构主要由延伸链和无规则卷曲构成，占比分别为33.88%和48.76%，α-螺旋和β-转角分别占8.26%和9.09%（图6）。三级结构预测发现，蛋白序列与PDB数据库中6xdc.1.A模板序列的相似性为22.09%（图7）。

图4 rM蛋白信号肽预测分析Fig.4 Prediction and analysis of signal peptide of rM protein

图5 rM蛋白跨膜预测分析Fig.5 Prediction and analysis of protein transmembrance of rM protein

图6 rM蛋白二级结构分析Fig.6 Secondary structure analysis of rM protein

图7 三维结构同源模型Fig.7 Three-dimensional homology model

2.4 重组菌株BL21（pET-28a-rM）的构建及鉴定

用T4 DNA连接酶将回收后的截短的M基因和线性化的载体pET-28a（+）连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒后，使用XhoⅠ和EcoRⅠ进行双酶切消化，经0.7%琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约5 300和366 bp的条带（图8），与预期相符。测序正确的质粒pET-28a-rM转化大肠杆菌BL21感受态细胞，获得鉴定正确的重组菌株BL21（pET-28a-rM）。

M,DL15000 DNA Marker；1,pET-28a-rM双酶切；2,pET-28a（+）双酶切；3，截短的M基因M,DL15000 DNA Marker;1,Double enzyme digestion of pET-28a-rM;2,Double enzyme digestion of pET-28a（+）;3,Truncated M gene图8 重组质粒pET28a-rM酶切鉴定Fig.8 Enzyme identification of recombinant plasmid pET28a-rM

2.5 rM蛋白的表达与纯化

2.5.1 rM蛋白的表达 将IPTG诱导过的重组菌株BL21（pET-28a-rM）、BL21（pET-28a）超声破碎，进行SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色2 h，脱色液脱色过夜。在约15 ku处有蛋白条带，其中，诱导剂IPTG终浓度为1 mmol/L时蛋白表达量最高（图9）。

M，蛋白质分子质量标准；1，空载体；2～5，IPTG浓度分别为0.5、0.8、1.0和1.5 mmol/LM，Protein Marker;1，Empty vector;2-5，The concentrations of IPTG were 0.5,0.8,1.0 and 1.5 mmol/L,respectively图9 SDS-PAGE检测rM蛋白表达情况Fig.9 Expression of rM protein detected by SDS-PAGE

2.5.2 rM蛋白的可溶性检测 将重组菌株BL21（pET-28a-rM）和BL21（pET-28a）置于200 r/min恒温摇床培养，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导后，破碎菌体，对处理后的上清与沉淀进行SDS-PAGE检测。由图10可知，上清中无条带出现，沉淀中有大小约15 ku的蛋白条带，说明目的蛋白以包涵体形式存在于沉淀中。

M，蛋白质分子质量标准；1，空载体；2，沉淀；3，上清M，Protein Marker;1，Empty vector;2，Supernatant;3，Precipitate图10 rM蛋白可溶性检验Fig.10 Detection of rM protein solubility

2.5.3 rM蛋白的纯化 将诱导后的沉淀溶解后，进行rM蛋白的纯化，对收集的洗脱液进行SDS-PAGE检测，得到了大小约为15 ku、纯度较高的rM蛋白（图11）。

M，蛋白质分子质量标准；1，空载体；2，纯化后的rM 蛋白M，Protein Marker;1，Empty vector;2，Purified rM protein图11 纯化蛋白rM检测Fig.11 Detection of purified protein rM

2.6 重组蛋白的 Western blotting 检测

以PEDV阳性血清作为一抗，对该蛋白进行Western blotting检测,结果显示，在约15 ku处出现了特异性条带，表明原核表达的rM蛋白能与PEDV阳性血清发生较好的免疫反应，而对照菌株不能发生反应（图12）。

M，蛋白质分子质量标准；1，空载体；2，重组菌株M，Protein Marker;1，Empty vector;2，Recombinant bacteria图12 Western blotting检测结果Fig.12 Western blotting results

2.7 多克隆抗体滴度测定

以表达的rM蛋白包被ELISA板，检测得到抗体的效价为1∶51 200（图13）。

图13 多克隆抗体效价测定Fig.13 Determination of polyclonal antibody titer

3 讨 论

自20世纪80年代中国首次分离到PEDV之后，很多省份及地区陆续报道了该病原的感染，PEDV已成为制约中国养猪业发展的主要传染病之一，因此对PEDV的及早诊断对于控制猪流行性腹泻具有重要意义[11]。PEDV属冠状病毒科成员，具有与其他冠状病毒属成员相似的病毒粒子形态[12-13]。传统的诊断方法主要实施病毒分离、免疫组化等技术，然而该病毒分离较困难，采用PEDV结构蛋白作为诊断抗原开发快速、简便的诊断方法是目前检测类产品发展的趋势。M蛋白是PEDV众多结构蛋白中较为保守的蛋白。然而研究表明，冠状病毒的M蛋白表达较困难[14-15]。因此，有必要对该蛋白序列进行生物信息学预测与分析，选择成熟的表达系统表达该蛋白，为进一步研究M蛋白的生物学功能奠定基础。本研究利用生物信息学软件对截短的M蛋白的结构及生物学信息进行了预测和分析。跨膜区预测显示该蛋白存在跨膜区，推测该蛋白主要以包涵体形式存在，这可为后续的纯化及研究奠定基础。该蛋白存在21个潜在的磷酸化位点，推测可能与细胞内信号转导和蛋白定位有关系。

尽管有报道指出M蛋白可通过真核表达系统进行表达，然而较低的蛋白获得量及较高的成本限制了其应用的范围。原核表达以其高效、低成本的优点已被广泛应用到生物技术中。吴凌等[16]构建了携带PEDVM基因的原核表达载体，但该载体在多种宿主细胞中并未表达。本研究初期曾尝试将M基因全基因克隆至原核表达载体进行表达，但未成功。Utiger等[17]研究结果表明，冠状病毒的M蛋白在体外表达较困难，可能与M蛋白对细菌的毒性有关。Chen等[18]也通过原核表达系统对M蛋白进行了表达，但在试验过程发现宿主菌有被抑制的现象，推测可能完整的M蛋白在细胞内蓄积之后，破坏了宿主菌的细胞壁，引起了细菌的死亡。蛋白的亲/疏水性程度与蛋白的表达有密切关系[19-20]。本研究选取了M基因亲水性较高的一段基因进行了表达，获得了高纯度的截短M蛋白。尽管很多研究涉及该蛋白的体外表达，但缺乏相应的条件摸索，这也可能导致了表达失败。本研究对重组蛋白的表达体系进行了优化，在37 ℃、1 mmol/L IPTG诱导12 h的条件下rM蛋白的表达量最高。

4 结 论

本研究成功获得了高纯度、截短的PEDV M蛋白，制备了高滴度的兔抗多克隆血清，对开发基于该截短蛋白的PEDV亚单位疫苗及检测生物制品的研发具有重要意义。