基于RAD-Seq技术的大围山微型鸡遗传进化分析

张会永，李国辉，薛 倩，周成浩，殷建玫，苏一军，夏树立，韩 威

（1.江苏省家禽科学研究所，扬州 225125；2.江苏省家禽科学研究所科技创新有限公司，扬州 225125；3.天津市农业科学院畜牧兽医研究所，天津 300381）

大围山微型鸡（Daweishan Mini chicken,WX）俗称“香鸡”、“金鸡”、“娇鸡”，原产地为云南省屏边县，属于肉蛋兼用和竞技观赏型地方品种，2011年收录于《中国畜禽遗传资源志·家禽志》[1]。在长期的自然选择和人工选择过程中，大围山微型鸡形成了独具一格的外貌特征和种质特性，具有体型小、胸腿肌发达、灵活好斗、耐粗饲、抗病性强等特点，是中国珍稀的家禽遗传资源。

针对大围山微型鸡的研究主要集中在表型、微卫星技术及线粒体DNA（mtDNA）的研究。李正田等[2]对310日龄不同性别大围山微型鸡的屠宰性能进行了测定分析，为品种的选育、开发利用提供了基础资料。佟荟全等[3]对大围山微型鸡生长曲线分析与拟合比较分析中发现，大围山微型鸡生长曲线拐点为6.94周龄。贾俊静等[4]利用微卫星标记法对大围山微型鸡遗传多样性进行分析，结果表明其平均杂合度和群体平均多态信息含量较低。贾晓旭等[5]基于mtDNA D-loop区全序列变异对大围山微型鸡遗传多样性及其起源进化关系进行研究，结果表明其遗传多样性较低，大围山微型鸡在遗传来源组成上具有4个血统。欧阳依娜等[6]对大围山微型鸡、云龙矮脚鸡和拉伯高脚鸡mtDNA D-loop遗传多样性分析的研究发现，大围山微型鸡由7个母系血统组成。

随着分子技术的不断发展，简化基因组测序（RAD-Seq）技术以高通量、成本低、操作简便、灵敏度高等特点[7]，一次运行可以获得0.45～200 Gb的数据，克服了微卫星标记及mtDNA遗传信息覆盖整个鸡基因组范围极其微小的缺点（FAO推荐用于鸡遗传多样性分析的微卫星标记约30个，线粒体DNA的D-loop区域全长也仅约1 200 bp[8]）,本试验利用RAD-Seq技术对大围山微型鸡及其他20个品种鸡进行测序分析，从分子水平上探讨大围山微型鸡的遗传进化，为品种保护、评价和开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

大围山微型鸡保种群体与其他18个地方鸡品种，包括北京油鸡（BY）、东乡绿壳蛋鸡（DX）、鹿苑鸡（LY）、河南斗鸡（DJ）、瓢鸡（PJ）、萧山鸡（XS）、文昌鸡（WC）、边鸡（BJ）、狼山鸡（LS）、白耳黄鸡（BE）、茶花鸡（CH）、仙居鸡（XJ）、安义瓦灰鸡（WH）、固始鸡（GS）、大骨鸡（DG）、惠阳胡须鸡（HX）、金湖乌凤鸡（JH）、藏鸡（ZZ）及2个国外引进品种隐性白羽肉鸡（RW）、安卡鸡（AK），每个品种按照家系选择30个样本（公鸡10只、母鸡20只），个体间无亲缘关系。在同一饲养条件下，300日龄时翅下静脉采血1.5 mL/只，柠檬酸钠（ACD）抗凝，-20 ℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取与质量检测 采用常规酚-氯仿法提取21个品种鸡血液样本基因组DNA，-20 ℃保存备用。使用紫外分光光度计对提取的DNA进行浓度和纯度的测定。

1.2.2 构建pair-end文库 检测合格的DNA样品，采用ddRAD建库方式构建长度范围在300～500 bp的pair-end文库：取基因组DNA 500 ng，加入0.6 UEcoRⅠ（NEB公司）、T4DNA连接酶（NEB公司）、ATP（NEB公司）和EcoRⅠ接头（含区分样品的Index序列）在37 ℃反应3 h，65 ℃退火1 h。然后加限制性内切酶NlaⅢ（NEB公司）和NlaⅢ接头在37 ℃反应3 h。反应结束后在PCR仪中65 ℃放置30 min使内切酶失活。使用1.2%琼脂糖凝胶电泳选择400～600 bp回收酶切产物。使用Qubit3.0（Life Technology公司）对回收产物进行DNA定量，等量混合样品。 使用IlluminaTruSeq试剂盒对混合产物进行DNA文库构建。

1.2.3 RAD-Seq简化基因组测序与SNP质控 在pair-end文库构建完成后，在IlluminaHiSeq X平台进行RAD-Seq简化基因组测序。SNP的检测使用GATK4.1.2.0和samtoolsl.9软件工具包，质控条件：碱基测序正确识别率（QPhred （20），Q20）>95%；SNP深度>60%，SNP检出率>70%，最小等位基因频率（minorallele frequency，MAF）>0.05。

1.3 统计分析

应用PopGen32软件进行平均杂合度（heterozygosity，Ho）、核苷酸多样度（Pi）、近交系数（Fis）和群体分化指数（Fst）计算。应用Admixture1.3.0软件进行群体聚类分析，采用PLINK1.90软件进行选择信号检测，基于Fst检验方法进行选择信号分析（以100 kb为窗口、10 kb为步长），Z/W性染色体位点不进行分析。 利用DAVID在线软件（https:∥david.ncifcrf.gov/）对受选择基因进行GO功能注释和KEGG信号通路分析。

2 结 果

2.1 SNP鉴定

通过数据质控，在大围山微型鸡群体中鉴定出331 892个SNPs，主要分布于1、2、3、4、5号和Z染色体上（图1），SNP位点数量与染色体长度总体上呈正相关。

图1 SNP在染色体上的分布Fig.1 Distribution of SNP on chromosomes

2.2 群体遗传多样性分析

21个品种的平均杂合度、核苷酸多样度和近交系数见表1，大围山微型鸡的平均杂合度为0.219；核苷酸多样度为0.245，与其他品种相比，呈中度多态；近交系数为0.107。

表1 各品种鸡的平均杂合度、核苷酸多样度和近交系数Table 1 Ho，Pi and Fis of chicken breeds

2.3 群体遗传结构分析

大围山微型鸡与其他18个地方鸡品种的Fst见表2，大围山微型鸡与瓢鸡的Fst最低（0.0929），亲缘关系最近；与河南斗鸡的Fst最高（0.2179），亲缘关系最远。对21个鸡种进行遗传结构聚类分析发现，大围山微型鸡与瓢鸡、茶花鸡和藏鸡聚合在一起（图2），亲缘关系较近。

表2 大围山微型鸡与其他品种鸡间的群体分化指数Table 2 Fst between WX and other chicken breeds

图2 大围山微型鸡及其他品种鸡的遗传进化树Fig.2 Phylogenetic tree of WX and other chicken breeds

2.4 选择信号分析

本研究基于Fst检验方法，大围山微型鸡分别与其他18个地方鸡品种比较，以100 kb为窗口、10 kb为step进行滑动的Fst选择信号分析,筛选Fst值前5%的位点作为选择位点，注释相应的基因，以≥10个品种受到选择的基因作为选取标准，共筛选出200个受到选择的基因。GO功能分析结果显示，这些受选择基因主要富集在对刺激的应答、信号传导、运动等生物过程（图3）。KEGG通路富集分析结果表明，这些受选择基因主要富集在新陈代谢、肌动蛋白细胞骨架的调节、RIG-Ⅰ样受体、Notch、MAPK、Apelin等信号通路（图4）。 根据GO功能和KEGG通路富集分析结果，对与大围山微型鸡种质特性相关基因进行初步筛选发现，NTRK2、SEMA3A、NTF3、NRG1基因与刺激反应信号传导等生物过程相关；NTRK2、GNAQ、GNA14、CRHBP基因与攻击行为相关；PDE4D、SEMA3A、AGGF1基因与心血管系统相关；ALDH1A1、PDE8B、ECH1、PTPRD基因与代谢相关；SEMA3A、NPR2基因与骨骼发育相关，TULP3、FOXP2基因与颅骨形成相关；PRPF3、GLI3、DIAPH3基因与视力、听觉感知相关；TRIM14、MALT1基因与免疫相关。

图3 受选择基因的GO功能分析Fig.3 GO function analysis of selected genes

图4 受选择基因的KEGG分析Fig.4 KEGG analysis of selected genes

3 讨 论

开展地方鸡保种群遗传多样性分析对保种工作至关重要，保种工作的核心工作之一就是确保种群世代传递过程中遗传多样性的稳态。贾静雯等[4]用微卫星方法测得的大围山微型鸡平均杂合度为0.1737，贾晓旭等[5]基于mtDNA D-loop区分析大围山微型鸡的核苷酸多样度为0.00443，上述研究说明大围山微型鸡的遗传多样性相对匮乏。本研究结果显示，大围山微型鸡的平均杂合度处于中等水平，核苷酸多样度处于中度多态。与前人研究不一致的原因可能是本研究对大围山微型鸡群体的采样更有代表性，囊括了其主要类型（白羽、白麻、黑麻、黄麻、黑花等，单冠、豆冠），采样个体表型上有一定差异。

大围山微型鸡的近交系数与其他18个地方鸡品种相比，处于中上水平，这提示在今后的保种工作中，应严格控制近交水平的过快增加，保持遗传多样性的相对稳定，必要时可从原产地引进一定数量的群体（或其他类群）进行血缘更新。群体遗传结构分析中与大围山微型鸡亲缘关系较近的3个地方鸡品种，从地理位置上看，大围山微型鸡与瓢鸡、茶花鸡同为云南省地方鸡品种，藏鸡在云南省西北部迪庆藏族自治州也有分布，具有明显的地域特征。

本研究基于Fst检验方法对大围山微型鸡种质特性相关基因进行筛选，共筛选出200个受选择的基因，进行了GO功能和KEGG通路分析。结果表明，与其他18个地方鸡品种及2个引入肉鸡品种相比，受选择候选基因显著富集于不同的生物学通路。

自然选择是进化的原动力，大围山微型鸡公鸡长期处于半野生半家养状态，为了保护种群应对野外的危险，因而具有较强的战斗力，与其他种群公鸡相比，它体型较小，成年公鸡的平均体重仅为1 kg左右，但斗性强。本研究发现，大围山微型鸡有着发达的神经系统，与刺激反应信号传导等生物学过程相关的基因NTRK2、SEMA3A、NTF3、NRG1等受到了选择。研究表明，NTRK2编码酪氨酸激酶受体B （TrkB），不仅可促进神经细胞生存，增加突触可塑性及神经发生[9-10]；SEMA3A是神经轴突发育的一个关键信号蛋白，通过结合神经纤毛蛋白1（NRP1）、神经纤毛蛋白2（NRP2）和丛状蛋白A（LXNA）复合物受体参与轴突排斥﹑树突分支、突触形成和神经元迁移过程[11]；NTF3是早期神经发生期间神经元发育的关键介质，在维持突触功能和突触形成中起重要作用，在神经营养蛋白选择性地结合特定的酪氨酸受体激酶存储信号在各种信号通路中的作用，对神经元的存活和轴突投射至关重要[12-14]；NRG1影响神经胶质细胞的发育与迁移、突触可塑性、髓鞘形成[15-17]。这些基因使得大围山微型鸡反应迅速、行动敏捷。

5-羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA）已被证实是调控攻击行为的主要神经递质[18]，本研究发现，与此相关的基因NTRK2、GNAQ、GNA14、CRHBP受到了选择。研究表明，NTRK2对5-羟色胺和多巴胺能神经元的生长发育、分化再生具有维持和促进作用[19]，GNAQ、GNA14通过磷脂酶C激活多巴胺受体信号通路[20-21]。李佳玉等[22]研究发现，CRHBP基因rs10062367位点多态性可能与攻击行为有关。本研究中还发现与心血管系统相关的基因PDE4D、SEMA3A、AGGF1等受到了选择。PDE4D能够调解心肌细胞收缩和心率[23]，SEMA3A能够降低室性心速过快[24]，AGGF1在诱导血管生成、血管发育以及血管损伤后新内膜形成发挥作用[25]。发达的心血管系统和充足的能量供应为大围山微型鸡打斗的爆发力和持久力、野外逃避危险的能力提供了保障。多个代谢通路（糖酵解和糖异生、甘油磷脂代谢、甘油酯代谢等）相关的基因ALDH1A1、PDE8B、ECH1、PTPRD受到了选择，这可能为大微山微型鸡打斗爆发力和持久力提供充足的能量。

大围山微型鸡骨细，而较强的斗性行为要求必须有坚硬的骨骼，本研究发现与骨骼发育相关的基因SEMA3A、NPR2等、与颅骨形成相关的基因TULP3、FOXP2，以及与视力和听觉感知相关的基因PRPF3、GLI3、DIAPH3等也受到了选择。研究表明，SEMA3A可促进成骨细胞和抑制破骨细胞的生成，并可调节骨重塑[26-27]；NPR2能够编码利纳肽B型受体（NPR-B），NPR-B与C型利纳肽结合促进骨骼基质的合成和刺激软骨的增殖分化[28]。研究发现，FOXP2基因能够调控颅骨形成和长骨骨重塑[29]；TULP3是正常胚胎发育所必需的,它的破坏导致胚胎颅面区域形态缺陷[30]，这些基因可能使得大围山微型鸡形成了独特的头部外貌特征。PRPF3在视网膜的发育过程中起重要作用[31]。GLI3可通过调节 Wnt/β-catenin信号传导来控制晶状体和视网膜的发育[32]。这些基因可能使大围山微型鸡能够面对野外生存危险保持足够的机警。在免疫调节方面，TRIM14和MALT1等基因受到了选择。TRIM14能够正向调控抗病毒天然免疫[33]，MALT1蛋白可以调控免疫细胞的生存和增殖分化，在神经系统损伤等多种疾病发挥作用[34]。这些基因可能与大围山微型鸡的抗病能力有关。本研究初步筛选出大围山微型鸡的特性及其相关基因，这些基因所在的通路及其作用还需要进一步的研究。

4 结 论

大围山微型鸡遗传多样性呈中度多态，与瓢鸡亲缘关系最近（Fst为0.0929），并筛选出了200个受到选择的基因，这些基因在代谢、信号传导、颅骨发育等多个方面发挥作用。结果为大围山微型鸡种质特性的深入挖掘、保护与开发利用提供了科学依据。