穿王消炎粉对LPS诱导大鼠急性肺损伤的治疗作用

王 璐，胡盼盼，程 佳，孙盼盼，孙 娜，范阔海，尹 伟，李宏全，孙耀贵

（中兽医药现代化山西省重点实验室，山西农业大学动物医学学院，太谷 030801）

穿王消炎粉是山西农业大学动物医学学院中兽医药现代化山西省重点实验室依据国家药品标准[1]收载的“穿王消炎片”（标准号为:WS-10487（ZD-0487）-2002，主要功效为消炎解毒，用于痰热咳喘，腹痛，以及急慢性扁桃腺炎、咽喉炎、肺炎，急性肠胃炎、急性菌痢见以上症状者），按照《中兽药、天然药物分类及注册资料要求》[2]属第三类下第2项“现代中兽药复方制剂”要求，将穿心莲和了哥王两味中药经提取制备而成，以为畜禽呼吸道和消化道感染性疾病的防治提供新的治疗药物，且满足在饲料中添加解决畜禽群体给药的需要。穿心莲是爵床科植物穿心莲（Andrographispaniculata（Burm.f.） Nees）的干燥地上部分[3]，性寒，味苦，归心、肺、大肠、膀胱经，主要功效为清热解毒、凉血、消肿，药用活性成分主要为二萜内酯类、黄酮类、苯丙素类、环烯醚萜类等，具有抗菌、抗病毒、抗炎、解热、免疫调节、抗肿瘤、抗心血管疾病等作用[4-5]，临床上主要用于治疗呼吸道和消化道感染等疾病[6]。 了哥王（Wikstroemiaindica）是瑞香科荛花属植物南岭荛花的干燥根或根皮[7]，性寒，味苦、微辛，归肺、肝经，具有清热解毒、化痰散结、消肿止痛、通经利水等功效，主要活性成分为香豆素类、黄酮类和木脂素类[8]，具有消炎、抑菌、抗病毒、抗肿瘤等作用[9]，主要用于治疗支气管炎、肺炎、风湿性关节炎等。

病原微生物感染引发的呼吸道疾病对畜禽养殖生产造成了严重的危害，其引起的急性肺损伤（ALI）是造成畜禽呼吸衰竭乃至死亡的重要原因[10]。研发安全、有效的用于防治ALI的新兽药已成为研究热点，对于降低畜禽呼吸道感染性疾病的发病率和死亡率具有重要意义。以脂多糖（LPS）为代表的生物因素诱导的ALI模型是评价筛选防治ALI药物的最常用的方法[11]。研究表明，穿心莲活性成分穿心莲内酯能够缓解LPS诱导的ALI[12]。有关了哥王对ALI的治疗作用的研究鲜见报道。本试验通过LPS诱导的ALI模型，开展穿王消炎粉对ALI的治疗作用研究，以为其后续临床试验研究、新兽药注册申报及在兽医临床中的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 60只体重160～200 g的SD雄性大鼠，购自北京斯贝福公司，饲养于山西农业大学实验动物管理中心（温度23～25 ℃，相对湿度40%～70%，12 h光/暗周期），以常规饲料喂养，自由饮水。

1.1.2 药物与试剂 穿王消炎粉制备：穿心莲和了哥王生药购自河北省安国市祁源中药材有限公司。按处方配比（3∶2）分别称取穿心莲和了哥王，将穿心莲粉碎成粗粉，用85%的乙醇热浸2次，每次2 h，合并提取液，静置并过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，浓缩成浸膏备用；了哥王水煎2次，每次5 h，混合煎液并过滤。将了哥王滤液与穿心莲浓缩液混合，浓缩成稠膏，低温烘干后粉碎、过筛成细粉。分别称量2、4、8 g穿王消炎粉干粉于20 mL CMC-Na溶液中，混合均匀。盐酸左氧氟沙星药液配制：称取14 mg盐酸左氧氟沙星药粉（盐酸左氧氟沙星胶囊，国药准字H19990051，购自扬子江药业集团有限公司）溶于20 mL CMC-Na溶液中，混合均匀。LPS（大肠杆菌055∶B5，货号L8880，纯度≥99%）购自Solarbio公司；白细胞介素-1β（IL-1β） ELISA试剂盒（货号：E02I0010）、IL-6 ELISA试剂盒（货号：E02I0006）均购自上海蓝基生物科技有限公司；TRIzol和两步法反转录试剂盒购自TaKaRa公司；RIPA buffer和BCA蛋白浓度检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；磷酸酶抑制剂购自Bimake公司；蛋白酶抑制剂购于Solarbio公司；蛋白Marker购自Thermo公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；IL-1β抗体（货号:bs-0812R）、IL-6抗体（货号:bs-0782R）和GAPDH抗体（货号:bs-10900R）均购自北京博奥森生物技术有限公司；山羊抗兔IgG（货号:CW0103S）购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器 石蜡切片机（Leica公司）；高速低温离心机（Eppendorf公司）；倒置显微镜（Leica公司）；7500定量PCR仪（Bio-Rad公司）；多功能酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司）；电泳仪（Bio-Rad公司）。

1.2 试验处理

将SD大鼠随机分为6组，具体为：空白组（Control）、左氧氟沙星阳性药物对照组（Levofloxacin）、LPS模型组（Model）、穿王消炎粉低剂量组（Low，1 g/kg体重）、穿王消炎粉中剂量组（Mid，2 g/kg体重）、穿王消炎粉高剂量组（High，4 g/kg 体重）。采用滴鼻LPS的方法制备大鼠ALI模型[13]。除空白组外,其余试验组大鼠均滴鼻LPS（3 mg/kg体重），24 h后穿王消炎粉给药组每日灌服相应浓度的穿王消炎粉溶液，阳性药物对照组灌胃左氧氟沙星溶液（7 mg/kg体重），空白组及模型组灌胃相同体积的生理盐水。每天16:00灌胃，在治疗的第4天处死，并剖检大鼠，采集肺脏样本。

1.3 观察和检测指标

1.3.1 临床症状观察 每日灌胃前观察各组大鼠的精神状态，饮食以及呼吸情况。

1.3.2 肺脏组织湿/干重比 从剖检的肺脏中收集右肺右上叶和右中叶，除去脂肪后立即称重。将称重后的肺脏组织放在60 ℃烘箱中干燥72 h，72 h后从烘箱中取出肺脏组织再次称重，并计算大鼠肺脏组织的湿/干重比。

1.3.3 肺脏组织病理学观察 取右肺右下叶和右后叶，除去肺脏组织表面的脂肪，用滤纸吸干表面液体，固定于Bouin’s液中24 h，将固定好的组织用70%酒精浸泡3次以上，每次6 h，脱水、透明、石蜡包埋，切厚度为5 μm的切片，通过梯度乙醇将切片脱水，然后进行苏木精-伊红（HE）染色，使用光学显微镜观察并拍摄组织病理学变化。

1.3.4 血清中IL-1β、IL-6含量 采用ELISA方法测定。将96孔酶标包被板各孔编号并记录，按照说明书依次在标准孔中加入不同浓度的标准品50 μL，空白孔加入50 μL样本稀释液，待测样品孔加入40 μL样本稀释液和10 μL待测样本，并设置3个平行，除空白孔外其余各孔均加入100 μL酶标试剂。用封板膜封住反应孔，37 ℃孵育1 h，洗板5次，后加入显色液，37 ℃避光反应15 min，加终止液50 μL，测定450 nm各孔吸光度，绘制标准曲线，计算样品实际蛋白浓度。

1.3.5 肺脏组织中IL-1β、IL-6 mRNA表达水平 取冻存的左肺组织放到装有液氮的研钵中，充分研磨后，称取0.2 g加入1 mL TRIzol，按步骤提取总RNA，经过反转录反应合成cDNA。 在NCBI数据库中查找目的基因序列，通过Primer Premier 5.0软件设计引物，由西安擎科泽西生物公司合成，引物序列见表1。以GAPDH为管家基因，采用实时荧光定量PCR检测IL-1β和IL-6基因的表达，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3.6 肺脏组织中IL-1β和IL-6蛋白表达量 将冻存的肺脏组织研磨后，每个样品用1 mL含蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的RIPA Buffer进行裂解，在冰上静置40 min，每隔10 min振荡1次，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，分层后的上清即为肺脏组织的总蛋白。利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定各组蛋白浓度后将蛋白变性（95 ℃，10 min）。SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入IL-1β抗体、IL-6抗体和GAPDH抗体,4 ℃摇床过夜孵育，后用TBST洗3次，每次10 min，加入山羊抗兔IgG室温孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，ECL化学发光法显影。内参对照为GAPDH，使用Image J软件通过扫描光密度测定法分析蛋白表达。

1.4 统计学分析

采用GraphPad Prism 8统计分析软件中单因素方差分析（One-Way ANOVA）和多重比较（LSD）分析各组大鼠各观测指标之间的差异，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结 果

2.1 大鼠的一般状况

建模期间，空白组大鼠表现正常，反应灵活，行动敏捷；其余5组以滴鼻法给予LPS后，食欲下降，被毛竖立，反应迟钝，呼吸急促，蜷缩抱团。用药4 d后，各给药组大鼠与LPS模型组大鼠相比，食欲增加，活动量增多，精神状态均比模型组大鼠好。

2.2 肺脏组织的湿/干重比

由图1可知，与空白组相比，LPS模型组大鼠肺脏组织的湿/干重比极显著增加（P<0.01）。与LPS模型组相比，穿王消炎粉组和左氧氟沙星组大鼠肺脏湿/干重比均不同程度降低（P<0.01），有剂量依赖性的趋势，其中穿王消炎粉中剂量组肺脏组织湿/干重比与低剂量组存在显著差异（P<0.05），高剂量组与中剂量组差异极显著（P<0.01），高剂量组与左氧氟沙星组无显著差异（P>0.05）。

肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05）；肩标不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著（P>0.05）。下同Values with different small letter superscripts mean significant difference （P<0.05）;And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference （P<0.01）;While with the same or no letter superscripts mean no significant difference （P>0.05）.The same as below图1 各组大鼠肺脏组织湿/干重比Fig.1 Rat wet/dry weight ratio in lung tissues of different groups

2.3 肺脏组织病理学变化

由图2可知，空白组无水肿无炎性细胞浸润，肺泡间隙清晰。LPS模型组中，观察到肺泡壁水肿和出血，肺泡间质增厚，肺泡结构破坏，肺泡腔内大量炎性细胞浸润和其他明显的肺损伤。与LPS模型组相比，穿王消炎粉各剂量组上述变化依次减轻，穿王消炎粉高剂量组肺脏组织间隙中性粒细胞和红细胞渗出明显减少，肺泡腔炎性细胞数量明显减少。

A,空白组;B,左氧氟沙星阳性药物对照组;C,LPS模型组;D,穿王消炎粉低剂量组;E,穿王消炎粉中剂量组;F,穿王消炎粉高剂量组A,Blank group;B,Levofloxacin-positive drug group;C,LPS model group;D,Chuanwang Xiaoyan powder low-dose group;E,Chuanwang Xiaoyan powder medium-dose group;F,Chuanwang Xiaoyan powder high-dose group图2 各组大鼠肺脏组织切片（HE染色）病理学变化（400×）Fig.2 Pathological changes of lung tissue sections （HE staining） in different groups （400×）

2.4 血清中IL-1β、IL-6的含量

由图3可知，与空白组相比，模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6含量均极显著升高（P<0.01）。与LPS模型组相比，穿王消炎粉中和高剂量组的IL-1β、IL-6含量均极显著降低（P<0.01），其中高剂量组IL-1β、IL-6含量与空白组无显著差异（P>0.05）。

图3 各组大鼠血清中IL-1β、IL-6含量Fig.3 Serum IL-1β and IL-6 contents of rats in different groups

2.5 肺脏组织中IL-1β和IL-6 mRNA表达量

由图4可知，与空白组相比，LPS模型组大鼠肺脏组织中炎性因子IL-1β和IL-6 mRNA表达量均极显著升高（P<0.01）。与LPS模型组相比，穿王消炎粉和左氧氟沙星处理均可极显著降低IL-1β和IL-6的mRNA表达量（P<0.01），其中穿王消炎粉高剂量组IL-1β和IL-6 mRNA表达量均与左氧氟沙星组均差异不显著（P>0.05）。

图4 各组大鼠肺脏组织中IL-1β、IL-6 mRNA表达量Fig.4 The mRNA expression levels of IL-1β and IL-6 in lung tissues of rats in different groups

2.6 肺脏组织中IL-1β和IL-6蛋白表达量

由图5可知，与空白组相比，LPS模型组IL-1β和IL-6蛋白表达量均极显著升高（P<0.01）。与LPS模型组相比，穿王消炎粉各组IL-1β和IL-6蛋白表达量随穿王消炎粉剂量增加呈降低趋势，高剂量组IL-1β和IL-6蛋白表达量和左氧氟沙星组均无显著差异（P>0.05）。

A,Western blotting条带图;B、C，分别为IL-1β和IL-6蛋白表达量A,Western blotting strip chart；B and C,Protein expression levels of IL-1β and IL-6,respectively图5 各组大鼠肺脏组织中IL-1β、IL-6蛋白表达量Fig.5 Protein expression levels of IL-1β and IL-6 in lung tissues of rats in different groups

3 讨 论

LPS建立ALI模型是目前最常见的呼吸系统疾病模型，通常用LPS诱导建立，给药途径有腹腔注射法、尾部静脉注射法、气管内给药法、滴鼻吸入法[14-16]。腹腔注射法和尾部静脉注射法均易引起全身炎症反应，剂量过大时还易导致试验动物死亡；气管内给药法对操作要求较高，切口处极易被微生物感染而出现炎症，影响试验结果；而滴鼻吸入法操作简便，且诱导急性肺部炎症较明显[14]。肖亚强等[17]通过滴鼻吸入法建立了大鼠ALI模型，模型大鼠表现为肺脏组织结构受损、水肿、肺泡及间质有炎性细胞浸润。水肿和出血是肺部炎性损伤的主要特征[18]。本研究通过滴鼻吸入LPS构建大鼠肺损伤模型，与空白组相比，模型组大鼠反应迟钝，呼吸急促，肺组织湿/干重比升高，病理组织切片观察到肺泡壁出血、水肿，间质增厚，表明模型构建成功。

研究表明，炎性因子含量急剧升高是急性炎症的共同表现[19-20]。LPS通过改变炎症相关蛋白的表达水平来诱导急性炎症[21-22]，在此过程中大量的炎性细胞被激活，产生炎症因子，最终造成肺损伤。研究显示，IL-1β和IL-6的分泌水平大幅上升会导致炎症反应，引起器官组织细胞损伤，对动物机体会产生伤害[23]。IL-1β作为炎症反应的早期物质，在炎症形成过程中起到了积极作用，可以促进其他促炎因子释放，维持炎症诱导反应，是IL-6表达的主要激活剂。IL-6主要由活化的巨噬细胞、淋巴细胞及上皮细胞分泌，其表达水平的高低可以指征炎症的轻重，可作为内毒素所致肺损伤模型中急性炎症的标志[24]，其作为促炎细胞因子，在宿主防御中起重要作用[25]。本试验结果表明，模型组大鼠的肺脏组织中肺泡间质增厚，出现积液，这可能是炎症因子大量释放所导致。穿心莲的主要成分是穿心莲内酯[26]，李学勤等[27]发现穿心莲内酯可以减少促炎因子IL-1β、IL-6分泌，进而减轻肺部损伤程度，对肺脏组织具有保护作用；张婕斐等[28]和柯雪红等[29]研究发现了哥王对急性炎症具有良好治疗效果；杨振宇等[30]发现了哥王水提物无毒性，同时对细菌也具有抑制作用。本试验用穿王消炎粉对ALI大鼠进行治疗，发现模型组大鼠肺脏的炎症因子IL-1β和IL-6的mRNA表达水平和蛋白表达量均显著高于空白组，穿王消炎粉处理组中以高剂量组（4 g/kg体重）IL-1β和IL-6水平降低最显著，说明穿王消炎粉可以通过降低IL-1β和IL-6的分泌水平对ALI起到治疗作用。

综上所述，穿王消炎粉（4 g/kg体重）可以明显改善LPS诱导的ALI和炎症程度，效果与阳性药左氧氟沙星相似。目前穿王消炎粉缓解肺损伤的机制尚不明确，后续将对其作进一步研究。

4 结 论

穿王消炎粉（4 g/kg体重）可以有效抑制LPS诱导的急性肺部损伤和炎症程度，减少炎症因子IL-1β和IL-6的分泌，对ALI有治疗作用。