槲皮素-替米考星混合物纳米粒的制备及对金黄色葡萄球菌小菌落变异株抗菌活性研究

刘金环，张珊玲，宋 玮，罗万和,2，陈 伟,2,3

（1.塔里木大学动物科学与技术学院，新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室，阿拉尔 843300；2.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，阿拉尔 843300；3.新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，阿拉尔 843300）

由金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，S.aureus）引起的奶牛乳腺炎导致全球每天损失380 t牛奶[1-2]。更严重的是，金黄色葡萄球菌常以小菌落变异株（Staphylococcusaureussmall colony variants，SASCVs）的形式在机体内持续存在，并形成生物被膜。研究表明，成膜的SASCVs菌株对抗菌药物和宿主免疫系统的清除作用有更强的抵抗力，进而导致奶牛反复和长期感染乳腺炎[3]。体外药敏试验结果表明，替米考星对金黄色葡萄球菌具有较强的抗菌活性，其最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）为2.2 μg/mL[4]。但替米考星具有较大的苦味，味觉敏感的动物口服替米考星时，容易拒食和引起反胃[5]。更为严重的是，替米考星难以穿透生物被膜，直接作用于SASCVs菌株。故临床上，替米考星对SASCVs菌株引起的奶牛乳腺炎疗效相对较差[6]。

作为黄酮醇类化合物的槲皮素具有多种生物活性，能抑制细菌胞外多糖基质的产生，从而减少胞外多糖蛋白复合物的形成，阻止SASCVs生物被膜进入成熟阶段，并且通过破坏生物被膜的完整性，使抗菌药物更易作用于细菌，从而起到抑制细菌生长的作用[7-9]。且槲皮素副作用小，无致畸、致癌、致突变等毒性作用，被广泛应用于临床中[10]。但槲皮素在水和有机溶剂中几乎不溶，且易降解，极大地限制了槲皮素生物活性的发挥[11]。鉴于此，本研究以槲皮素为中草药，替米考星为化学合成药，制备一种槲皮素-替米考星混合物纳米粒，用于治疗由SASCVs菌株引起的奶牛乳腺炎。本试验通过筛选槲皮素-替米考星混合物纳米粒最优反应条件，对比槲皮素-替米考星混合物纳米粒和商品化替米考星溶液对SASCVs菌株的抗菌活性，评价槲皮素-替米考星混合物纳米粒的优势以期为治疗由SASCVs菌株引起的奶牛乳腺炎提供基础研究资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 SASCVs菌株由新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室提供。

1.1.2 药品与试剂 替米考星原料药（1404001）购自武汉维物起源生物科技有限公司；替米考星标准品（K0310711）购自中国兽医药品监察所，纯度为91.0%；槲皮素原料药（20111013）购自上海源叶生物科技有限公司，纯度为98.5%；替米考星溶液（030142264）购自河北地邦动物保健科技有限公司；聚乙二醇6000（981007）购自天津永晟精细化工有限公司；β-环糊精（20190319）和聚乙烯醇（P8136）均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 主要仪器 集热式恒温磁力搅拌器（DF-101S）购自上海力辰邦西仪器科技有限公司；加热磁力搅拌器（IT-07A3）购自上海沪西股份有限公司；涡旋振荡仪（XW-80A）购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司；激光纳米粒度仪（ZS3600）购自丹东百特仪器有限公司；生物显微镜（BX41）购自Olympus公司；恒温恒湿培养箱（LRH-250-S）购自上海悦丰仪器仪表有限公司；扫描电子显微镜（JSM-6390LV）购自NTC公司；高通量实时微生物生长仪（MicroScreen HT）购自杰灵仪器制造有限公司。

1.2 槲皮素-替米考星混合物纳米粒的制备

1.2.1 最优配方用量的筛选 称取一定量的槲皮素（0.05、0.10、0.15和0.20 g）分别溶解于7.5% 20 mL的聚乙二醇溶液中，再称取一定量的替米考星原料药（0.2、0.3、0.4和0.5 g）分别加入到槲皮素-聚乙二醇混合溶液中，保证药物含量最高，且无沉淀、变色、产生气体、异物或其他变质现象的槲皮素和替米考星原料药用量为最优用量。

1.2.2 最优反应条件的筛选 结合槲皮素与替米考星理化性质，选取聚乙二醇溶液浓度（5.0%、7.5%、10.0%）、转速（500、1 000、1 500 r/min）、反应时间（0.5、1.0、2.0 h）、反应温度（25、50、75 ℃）为影响因素，设计L9（34）正交试验（表1）。以所制备槲皮素-替米考星混合物纳米粒的外观性状为评价指标筛选出槲皮素-替米考星混合物纳米粒的最优反应条件。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factor level table of orthogonal test

1.2.3 最优槲皮素-替米考星混合物纳米粒的制备 精确称取1.2.1筛选出的槲皮素和替米考星原料药的最优用量，根据1.2.2所筛选出的最优反应条件，在最优转速下分别依次加入到20 mL最优浓度聚乙二醇溶液中，在最优的温度下加热并搅拌一定时间，最后将混合溶液通过0.45 μm的微孔滤膜，即得到最优槲皮素-替米考星混合物纳米粒。根据《中国兽药典（2010版）》[12]中对于液体制剂的要求，观察槲皮素-替米考星混合物纳米粒的外观性状，包括气味、颜色、状态等，判断其有无变色、发霉、产生气体、异物或其他变质现象。

1.3 表征

1.3.1 微观形态 准确量取所制备的槲皮素-替米考星混合物纳米粒100 μL，于光学显微镜下观察其形态。并准确量取该纳米粒1 mL，用蒸馏水稀释100倍并摇匀，吸取2 μL样品滴在带有薄膜的铜网上，待其干燥后通过扫描电镜观察纳米粒形态。

1.3.2 沉降体积比 准确量取30 mL槲皮素-替米考星混合物纳米粒置于量筒中并摇匀，放置于水平面上静置3 h，将沉降前悬浮物的液面初始高度记录为H0，待静置3 h后观察沉降物部分的高度不再改变时为记为H，其沉降体积比（F）为H/H0。

1.3.3 再分散性 准确量取30 mL槲皮素-替米考星混合物纳米粒于量筒中，室温下放置1周后，以20 r/min的速度旋转，根据量筒中的纳米颗粒是否能重新均匀分散来评价槲皮素-替米考星混合物纳米粒的再分散性。

1.3.4 Zeta电位和粒径 准确量取200 μL槲皮素-替米考星混合物纳米粒，用蒸馏水稀释100倍，保存于5 mL离心管中备用，使用马尔文纳米激光粒度仪测定Zeta电位和粒径，每次试验重复测定3次，取平均值。

1.4 抗菌活性评价

1.4.1 SASCVs菌株生长曲线的绘制 挑取单个SASCV菌落接种于2 mL MH肉汤培养基中。用Micro Screen高通量实时微生物生长仪记录细菌的浓度。以细菌浓度的对数（lg CFU/mL）的平均值为纵轴，以时间为横轴绘制SASCVs菌株在MH肉汤培养基中的生长曲线。

1.4.2 琼脂扩散法测定抑菌圈 取100 μL对数生长期SASCVs菌悬液，均匀涂布在MH琼脂培养基表面。涂布均匀后，在每个平板上打4个孔，分别加入生理盐水和浓度为10 μg/mL的市售替米考星溶液、替米考星标准品和槲皮素-替米考星混合物纳米粒各100 μL。将琼脂板置于37 ℃培养箱中培养24 h后，用游标卡尺测定并对比各剂型在琼脂板中抑菌圈直径的大小。

1.4.3 微量肉汤稀释法测定MIC 采用微量肉汤稀释法测定市售替米考星溶液、替米考星原料药和槲皮素-替米考星混合物纳米粒对SASCVs菌株的MIC。将市售替米考星溶液、替米考星标准品和槲皮素-替米考星混合物纳米粒用MH肉汤倍比稀释成终浓度为32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125和0.06 μg/mL。 将稀释好的药物和菌液（1×106CFU/mL）按体积比1∶1混于96孔板中，使接入96孔板中细菌终浓度为5×105CFU/mL左右。在15 min内完成96微孔板的混菌。设置只含菌液不含药物的阳性对照孔和只含培养基不含菌的阴性对照孔。设置3个平行且至少重复3次，于37 ℃普通培养箱中培养24～36 h。并以金黄色葡萄球菌ATCC 29213、药物环丙沙星作质控。每次测定MIC值必须保证质控菌的结果符合规定的质控范围试验结果才有效；否则所有结果作废[13]。

1.4.4 不同替米考星制剂对SASCVs菌株的体外杀菌曲线 配制含1/2MIC、1MIC、2MIC、4MIC、8MIC、16MIC市售替米考星溶液、替米考星原料药和槲皮素-替米考星混合物纳米粒的MH肉汤1 mL，另以空白肉汤作为生长对照。将不同浓度的含药肉汤置于无菌细菌瓶中，分别加入1 mL对数期的SASCVs菌液，对照组做同样处理，混匀后置于培养箱中37 ℃静置培养。取空白对照瓶进行细菌计数，得初始细菌浓度。于0、1、2、4、8、12、18、24、48和72 h分别吸取培养液100 μL稀释后进行细菌计数，计数时设置3个平行取平均值。得到各时间点不同浓度存活菌落数后，取此对数值为纵轴，时间点为横轴绘制杀菌曲线，分析市售替米考星溶液、替米考星原料药和槲皮素-替米考星混合物纳米粒对SASCVs菌株的杀菌作用。

1.5 数据统计分析

试验结果以平均值±标准差表示，使用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，比较替米考星标准品、槲皮素-替米考星混合物纳米粒和市售替米考星溶液抑菌活性的差异显著性，P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 槲皮素-替米考星混合物纳米粒最优配方和条件筛选

以外观性状为评价指标，当替米考星为0.4 g、槲皮素为0.1 g、溶剂为20 mL 7.5%的聚乙二醇溶液，在转速为1 000 r/min、反应时间为1 h、反应温度为50 ℃时，所制备的槲皮素-替米考星混合物纳米粒最优，其颜色清亮，无沉淀和絮状物，且无发霉、变色、产生气体等其他变质现象（图1）。

图1 槲皮素-替米考星混合物纳米粒的外观性状Fig.1 Appearance properties of quercetin-tilmicosin mixture nanoparticles

2.2 表征

2.2.1 微观形态 光学显微镜下最优配方的槲皮素-替米考星混合物纳米粒分布均匀，颗粒大小一致（图2A）；扫描电镜下最优配方的槲皮素-替米考星混合物纳米粒颗粒大小均一，分布均匀，表面光滑平整（图2B）。

A，光镜下图像（800×）;B，SEM图像（10 000×）A，Light microscope image （800×）;B，SEM images（10 000×）图2 槲皮素-替米考星混合物纳米粒微观形态Fig.2 Microscopic morphology of quercetin-tilmicosin polymer nanoparticles

2.2.2 沉降体积比 所制备槲皮素-替米考星混合物纳米粒的F 值为1，表明该纳米粒稳定性高。

2.2.3 再分散性 量筒下部的槲皮素-替米考星混合物纳米粒能够很快地重新均匀分散且流动性良好，表明该纳米粒不易凝集，再分散性良好。

2.2.4 Zeta电位和粒径 所制备最优配方的槲皮素-替米考星混合物纳米粒Zeta 电位为-7.69 mV（图3A），粒径为741.9 nm（图3B）。

图3 槲皮素-替米考星混合物纳米粒Zeta电位（A）和粒径（B）Fig.3 Zeta potential （A） and particle size （B） of quercetin-tilmicosin polymer nanoparticles

2.3 抗菌活性评价

2.3.1 SASCVs菌株生长曲线 SASCVs菌株在MH肉汤培养基中的生长曲线如图4所示。在1～3 h时，细菌生长缓慢，处于迟缓期；在4～24 h时，细菌生长迅速，细菌数目以几何级数增加，处于对数生长期。 在25～28 h时，细菌生长数与死亡数几乎相等，活菌数目不增不减，处于稳定期。 在29～48 h，死亡细菌数目逐渐上升，活菌数减少，处于衰亡期。

图4 SASCVs菌株在MH肉汤中的生长曲线（n=3）Fig.4 Growth curve of SASCVs strain in MH broth （n=3）

2.3.2 琼脂扩散法测定抑菌活性 替米考星标准品、槲皮素-替米考星混合物纳米粒和市售替米考星溶液的抑菌圈直径分别为（2.54±0.51）、（1.51±0.23）和（1.38±0.17）cm，槲皮素-替米考星混合物纳米粒的抑菌区域比相同浓度的市售替米考星溶液略大，小于替米考星标准品，但三者之间差异均不显著（P>0.05）。

2.3.3 微量肉汤稀释法测定抑菌活性 替米考星标准品、槲皮素-替米考星混合物纳米粒和市售替米考星溶液对SASCVs菌株的MIC分别为1、1和2 μg/mL。由此可见，替米考星标准品和槲皮素-替米考星混合物纳米粒对SASCVs菌株的MIC相等，且小于市售替米考星溶液对SASCVs菌株的MIC，但三者之间差异均不显著（P>0.05）。

2.3.4 体外杀菌曲线 替米考星标准品、槲皮素-替米考星混合物纳米粒和市售替米考星溶液对SASCVs菌株的体外杀菌曲线如图5所示。结果表明，替米考星标准品、槲皮素-替米考星混合物纳米粒和市售替米考星溶液对SASCVs菌株均具有较强的杀菌能力，且3种药物均随浓度的增加，对SASCVs菌株的杀菌效果随之增加。当替米考星标准品为2MIC时（4 μg/mL）、槲皮素-替米考星混合物纳米粒为1MIC（1 μg/mL）和市售替米考星为1MIC（1 μg/mL）时，均已经表现出杀菌作用。

图5 替米考星标准品（A）、市售替米考星溶液（B）和槲皮素-替米考星混合物纳米粒（C）对SASCVs菌株的抑菌活性Fig.5 Antibacterial activity of tilmicosin standard （A）,commercial tilmicosin solution （B） and quercetin-tilmicosin polymer nanoparticles （C） against SASCVs strain

3 讨 论

奶牛乳腺炎给奶牛业带来了巨大损失，由于SASCVs菌株可在机体内持续存在，会引起奶牛持续性和反复性感染乳腺炎[14-16]。虽然替米考星对金黄色葡萄球菌的MIC值较低，具有较强的抗菌活性，但SASCVs菌株表面易形成生物被膜，常规抗菌药物剂型难以穿透生物被膜直接作用于SASCVs菌株，常引起奶牛乳腺炎治疗失败[17-19]。槲皮素通过阻止SASCVs生物被膜进入成熟阶段，破坏生物被膜的完整性，使抗菌药物更易作用于细菌，从而起到抑制细菌生长的作用，被广泛应用于临床中[20-21]。当槲皮素-替米考星混合物纳米粒作用于SASCVs生物被膜，槲皮素会破坏SASCVs生物被膜的完整性，可有助于替米考星穿透生物被膜，直接作用于SASCVs菌株，从而起到杀菌作用。故本研究以槲皮素为中草药，替米考星为化学合成药，制备一种适用于治疗由SASCVs菌株引起奶牛乳腺炎的槲皮素-替米考星混合物纳米粒。

本试验以外观性状筛选槲皮素-替米考星混合物纳米粒最优配方，发现槲皮素的溶解性较差，与文献报道一致[22-23]。当替米考星为0.4 g、槲皮素为0.1 g、溶剂为20 mL 7.5%的聚乙二醇溶液，在转速为1 000 r/min、反应时间为1 h、反应温度为50 ℃时，可获得槲皮素-替米考星混合物纳米粒最优配方。其外观形性状符合《中国兽药典（2010版）》[12]中对于液体制剂的要求。光学显微镜和扫描电镜下的槲皮素-替米考星混合物纳米粒分布均匀，颗粒大小一致；根据《中国兽药典（2010版）》[12]规定沉降体积比F值不得低于0.9。F值越大，表示沉降物的高度越接近纳米粒的原始高度，纳米粒就越稳定[12]。本研究所制备槲皮素与替米考星混合物纳米粒的F值为1，表明该纳米粒稳定性高[24]。且该纳米粒能够很快地重新均匀分散且流动性良好，表明该纳米粒不易凝集，再分散性良好[25]；该纳米粒平均粒径为741.9 nm，与其他文献报道的替米考星纳米粒[26-28]相比，粒径偏大；Zeta电位为-7.69 mV，有利于该混合物纳米粒制剂通过静电作用与SASCVs生物被膜表面正电荷相作用，并吸附于生物被膜表面，从而更有利于该纳米粒破坏SASCVs生物被膜的完整性，促进替米考星穿透生物被膜，直接作用于SASCVs菌株[29]。因此，本试验所研制的槲皮素-替米考星混合物纳米粒符合纳米粒的制备要求。

肉汤培养基中，SASCVs菌株在1～3 h处于迟缓期，4～24 h处于对数期，25～28 h处于稳定期，29～48 h处于衰亡期，符合常规细菌生长规律[30]。3种不同制剂的抑菌圈直径大小表现为替米考星标准品>槲皮素-替米考星混合物纳米粒>市售替米考星溶液。由此可见，槲皮素-替米考星混合物纳米粒的抑菌区域比相同浓度的市售替米考星溶液略大，但小于替米考星标准品。此结果可能是由于槲皮素的加入，使纳米粒的抑菌圈直径大于市售替米考星溶液。但是又由于在琼脂培养基中，纳米粒扩散较差，故纳米粒的抑菌圈直径小于替米考星标准品[31]。且微量肉汤稀释法测定MIC值发现，替米考星标准品和槲皮素-替米考星混合物纳米粒对SASCVs菌株的MIC相等，且小于市售替米考星溶液对SASCVs菌株的MIC值，表明槲皮素-替米考星混合物纳米粒和替米考星标准品具有相同的杀菌活性，且强于市售替米考星溶液。当药物浓度为4、8和16MIC时，8 h内杀菌速度和程度仍然相应增加，即为浓度依赖性的药物[32-33]。所以，由体外杀菌曲线可知，替米考星标准品、槲皮素-替米考星混合物纳米粒和市售替米考星溶液对SASCVs菌株的杀菌能力呈现出浓度依赖性，即替米考星浓度越大，对SASCVs菌株的杀菌效果就越强。且根据杀菌速率和程度，发现槲皮素-替米考星混合物纳米粒对SASCVs菌株的杀菌能力略大于替米考星标准品，明显大于市售替米考星溶液。

4 结 论

本研究所制备的槲皮素-替米考星混合物纳米粒对SASCVs菌株具有较强的杀菌能力，可为治疗由SASCVs菌株引起的奶牛乳腺炎提供基础研究资料。