猪骨骼肌纤维类型和能量代谢相关基因的表达特性研究

张燕伟，蔡春波，孙 迪，安家岐，黄晓宇，牛 瑾，崔子旭，高鹏飞，郭晓红，李步高，曹果清

（山西农业大学动物科学学院，太谷 030801）

骨骼肌是哺乳动物机体的重要组成部分，参与动物生理及代谢活动，约占机体总干重的45%[1]。骨骼肌的基本组成单位是肌纤维，多根肌纤维聚合形成由肌膜包裹的肌纤维束，多条肌纤维束构成骨骼肌[2]。骨骼肌肌纤维的直径、密度和横截面积与肌肉嫩度具有显著的相关性，可影响肉品质。骨骼肌肌纤维直径和横截面积越小，密度越大，肌肉的嫩度越好，肉质品质更高[3-4]。根据收缩速度与能量代谢的差异，骨骼肌肌纤维可以分为4种类型：慢速收缩氧化型（Ⅰ型）、快速收缩氧化型（Ⅱa型）、快速收缩酵解型（Ⅱb型）和中间型（Ⅱx型）[5-6]，对应的标记基因分别为肌球蛋白重链7（myosin heavy chain 7，MYH7）、MYH2、MYH4和MYH1[7]，4种类型肌纤维的形态和能量代谢方式具有较大的差异。Ⅰ型肌纤维直径和横截面积小，糖酵解代谢活性低，氧化磷酸化代谢活性高；Ⅱa型肌纤维直径和横截面积较小，糖酵解代谢活性较低，氧化磷酸化代谢活性较高；Ⅱb型肌纤维直径和横截面积大，糖酵解代谢活性高，氧化磷酸化代谢活性低；Ⅱx型肌纤维属于Ⅱa型和Ⅱb型肌纤维的过渡形态，糖酵解和氧化磷酸化活性处于两者之间[8-9]。

影响哺乳动物骨骼肌肌纤维组成的因素很多，包括年龄、品种、肌肉部位、饲养水平及饲养环境等[10]。猪骨骼肌肌纤维数目在胚胎期90 d已经确定，出生后数量不会改变，但是会增粗和变长[11]。仔猪骨骼肌中主要以氧化型肌纤维为主，随着年龄增长，氧化型肌纤维向酵解型肌纤维转化[12]。与国外猪种相比，中国地方猪骨骼肌中Ⅰ型肌纤维较多，Ⅱb型肌纤维较少[13]。猪不同部位骨骼肌的运动强度不同，肌纤维的组成也具有较大差异。猪背最长肌可以使脊柱保持直立，运动强度较小；而趾长伸肌位于小腿前侧，参与猪后腿直立和行走等功能，运动强度较大。杨秋梅[14]报道，6月龄大白猪背最长肌中慢肌含量为13.5%，快肌为86.5%；趾长伸肌中慢肌含量为8%，快肌为92%，运动强度较高的趾长伸肌的快肌含量高于背最长肌。

马身猪是山西省地方猪种，具有肌内脂肪含量高、肉质品质好、耐粗饲、抗逆性强等优良的种质特性，但其生长速度慢、饲料报酬低、瘦肉率低、皮下脂肪含量高，严重限制其商业化推广与应用[15-16]。晋汾白猪是以马身猪、二花脸、大白猪和长白猪为亲本，经杂交选育而成的新品种，通过国家畜禽遗传资源委员会审定，融合了中国地方猪种和国外商品猪种的优良特性，具有生长速度快、瘦肉率高和肉质品质好的优点，是一个优良的华系培育品种[17]。本研究以马身猪、晋汾白猪和杜长大猪为研究对象，采集背最长肌与趾长伸肌，分别检测4种肌纤维类型的标记基因（MYH7、MYH2、MYH4、MYH1）、线粒体活性相关基因（ATP5A1、PGC1-α、PPARβ）、电子传递链相关基因（UQCRC2、SDHA、NDUFA9）及糖酵解相关基因（LDHA、LDHB、GK）的表达量，探究3个猪种骨骼肌差异性的分子机制，以期为猪肉品质的研究提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 选取28 d断奶杜长大猪（简称DLY）、晋汾白猪（简称JFW）、马身猪（简称MS）去势公猪各4头，相同条件下饲养，自由采食。6月龄时屠宰，采集背最长肌（简称LD）和趾长伸肌（简称EDL），一部分修成1 cm×1 cm×0.5 cm的组织块，置于4%多聚甲醛固定液中，用于后续制作石蜡组织切片；另一部分组织-80 ℃保存，用于提取总RNA。

1.1.2 主要试剂及仪器 4%多聚甲醛、二甲苯、石蜡、中性树胶、HE染色试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit、SYBR Premix ExTaqTMⅡ均购自TaKaRa公司；RNA提取试剂盒购自Promega公司。

M60切片机、HI1220烘片机、HI1210摊片机、EG1150H智能生物包埋机（Leica Biosystems公司）；CFX Connect荧光定量PCR仪（Applied Biosystems公司）；Centrifuge 5415R高速冷冻离心机（Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 制作石蜡切片 骨骼肌样品经4%多聚甲醛固定24 h后流水冲洗过夜；使用70%乙醇2 h、80%乙醇2 h、90%乙醇2 h、100%乙醇1 h梯度脱水，脱水完成后，使用二甲苯对蜡块进行透明处理1 h；将组织块浸入60 ℃蜡罐中3 h，浸蜡完成后进行包埋；借助专用切片机将其制成5 μm厚度的切片，置于载玻片上47 ℃摊片，贴片后45 ℃烤箱烘片7 h，备用。

1.2.2 HE染色 将烘干的切片置于二甲苯中脱蜡，并在梯度酒精中进行逐级复水处理；使用苏木精染液对细胞核着色2.5 min，蒸馏水洗1 min返蓝后，将切片放入1%盐酸酒精溶液中分化10 s，水洗2 min；用伊红染液对细胞质着色2.5 min，蒸馏水洗1 min；着色结束后使用梯度酒精逐级脱水，二甲苯透明，用中性树胶封片。每张切片随机选择10个视野拍摄取图，保证每个视野内至少包含100根肌纤维。用Image-Pro Plus 6.0软件进行肌纤维直径、密度、横截面积的测量。

1.2.3 RNA提取和cDNA合成 使用RNA提取试剂盒提取组织RNA。加入适量无菌水溶解RNA，用核酸蛋白检测仪测定RNA浓度。参照反转录试剂盒说明书进行cDNA合成：去除基因组DNA，分别加入gDNA Eraser 1 μL，5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，总RNA 500 ng，加RNase-free ddH2O补齐至10 μL，混匀后42 ℃ 2 min；加PrimeScriptTMRT Enzyme Mix 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，RNase-free ddH2O 4 μL，5×PrimerScrept Buffer 2 4 μL，总体系20 μL，混匀后37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s，4 ℃保存。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测 采用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物，以18S rRNA作为内参基因，引物序列见表1。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反应体系20 μL：SYBR Premix ExTaqTMⅡ 10 μL，上、下游引物各0.6 μL，cDNA 1.5 μL，加无菌水补足体系。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，退火（退火温度见表1） 20 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt计算基因的相对表达量。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.2.5 统计分析 采用SPSS 21.0软件的单因素方差分析和独立样本t检验分析差异显著性。数据采用平均值±标准误表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 肌纤维形态分析

经过HE染色后，3个猪种的背最长肌和趾长伸肌肌纤维的细胞质显示为红色，边界清晰；细胞核显示为蓝色，分布在细胞边缘（图1）。

由图2可知，马身猪背最长肌肌纤维直径和横截面积均显著低于晋汾白猪和杜长大猪（P<0.05），而肌纤维密度显著高于晋汾白猪和杜长大猪（P<0.05），晋汾白猪和杜长大猪背最长肌肌纤维直径、密度和横截面积均无显著差异（P>0.05）；马身猪和晋汾白猪趾长伸肌肌纤维直径和横截面积均显著低于杜长大猪（P<0.05），而肌纤维密度显著高于杜长大猪（P<0.05），马身猪和晋汾白猪趾长伸肌肌纤维直径、密度和横截面积均无显著差异（P>0.05）。

肩标不同字母表示差异显著（P<0.05）；肩标相同字母表示差异不显著（P>0.05）Value with different letter superscripts mean significant difference （P<0.05）；While with the same or no letter superscripts mean no significant difference （P>0.05）图2 马身猪、晋汾白猪、杜长大猪背最长肌与趾长伸肌肌纤维直径（A）、密度（B）与横截面积（C）Fig.2 Diameter （A）,density （B） and cross-sectional area （C） of myofibers of longissimus dorsi muscle and extensor digitorum longus muscle in MS,JFW and DLY pigs

2.2 4种类型肌纤维标记基因的表达量分析

由表2可知，马身猪背最长肌中Ⅰ型肌纤维标记基因MYH7的表达量显著高于晋汾白猪和杜长大猪，晋汾白猪背最长肌中MYH7基因的表达量显著低于杜长大猪（P<0.05）；马身猪背最长肌中Ⅱb型和Ⅱx型肌纤维的标记基因MYH4和MYH1的表达量均显著低于晋汾白猪和杜长大猪，而Ⅱa型肌纤维的标记基因MYH2的表达量显著高于晋汾白猪和杜长大猪（P<0.05）。马身猪和晋汾白猪趾长伸肌中MYH7基因的表达量显著高于杜长大猪，而MYH4和MYH1基因的表达量均显著低于杜长大猪（P<0.05）；马身猪趾长伸肌中MYH2基因的表达量显著高于晋汾白猪和杜长大猪，晋汾白猪趾长伸肌中MYH2基因的表达量显著高于杜长大猪（P<0.05）。两种肌肉相比，背最长肌中MYH2和MYH7基因的表达量显著或极显著高于趾长伸肌，而MYH1和MYH4基因的表达量显著或极显著低于趾长伸肌（P<0.05；P<0.01）。

2.3 线粒体相关基因的表达量分析

由表3可知，马身猪背最长肌中ATP5A1、PGC1-α和PPARβ基因的表达量均显著低于杜长大猪，晋汾白猪背最长肌中PGC1-α和PPARβ基因的表达量均显著低于杜长大猪（P<0.05）；马身猪和晋汾白猪趾长伸肌中ATP5A1、PGC1-α和PPARβ基因的表达量均显著低于杜长大猪（P<0.05）。马身猪背最长肌中PGC1-α和PPARβ基因的表达量均显著低于趾长伸肌（P<0.05），ATP5A1基因的表达量在两种肌肉中无显著差异（P>0.05）；晋汾白猪背最长肌中ATP5A1和PGC1-α基因的表达量均显著低于趾长伸肌（P<0.01），PPARβ基因的表达量在两种肌肉中无显著差异（P>0.05）；杜长大猪背最长肌中ATP5A1、PGC1-α和PPARβ基因的表达量均极显著低于趾长伸肌（P<0.01）。

2.4 电子传递链相关基因的表达量分析

由表4可知，晋汾白猪背最长肌中UQCRC2、SDHA和NDUFA9基因的表达量均显著低于杜长大猪和马身猪，马身猪中NDUFA9基因的表达量显著低于杜长大猪（P<0.05）；杜长大猪趾长伸肌中UQCRC2、SDHA和NDUFA9基因的表达量均显著高于晋汾白猪和马身猪（P<0.05），晋汾白猪中UQCRC2和SDHA基因的表达量均显著高于马身猪（P<0.05）。比较电子传递链相关基因在背最长肌和趾长伸肌中的表达量发现，除杜长大猪背最长肌和趾长伸肌中NDUFA9基因的表达量无显著差异外（P>0.05），其余均有显著或极显著差异（P<0.05；P<0.01），且在背最长肌中的表达量高于趾长伸肌。

2.5 糖酵解相关基因的表达量分析

由表5可知，马身猪和晋汾白猪背最长肌中LDHA、LDHB和GK基因的表达量均显著低于杜长大猪，晋汾白猪背最长肌中LDHA基因的表达量显著高于马身猪（P<0.05）；马身猪和晋汾白猪趾长伸肌中LDHA、LDHB和GK基因的表达量均显著低于杜长大猪，晋汾白猪趾长伸肌中LDHA基因的表达量显著高于马身猪（P<0.05）。3个品种趾长伸肌中LDHA、LDHB和GK基因的表达量均显著高于背最长肌（P<0.05）。

3 讨 论

剪切力与肉品质具有显著的相关性，也与骨骼肌肌纤维直径、密度和横截面积存在显著的相关性。肌纤维直径越小，密度越大；肌肉剪切力越小，肉品质也更好[3]。谌启亮等[18]测定了18、36、54、72月龄西门塔尔杂交公牛背最长肌肌纤维直径与剪切力并进行相关性分析，结果发现剪切力与肌纤维直径的相关系数为0.833。陈璐等[19]测定了6个杂交组合的背最长肌肌纤维直径、密度和剪切力，结果发现背最长肌肌纤维直径与密度之间呈显著负相关，相关系数为-0.83，直径与剪切力呈显著正相关，相关系数为0.966。本研究发现，马身猪背最长肌和趾长伸肌肌纤维直径和横截面积均显著低于杜长大猪，说明马身猪骨骼肌的剪切力小于杜长大猪；培育品种晋汾白猪背最长肌肌纤维直径和横截面积与杜长大猪没有明显差异，而趾长伸肌肌纤维直径和横截面积均小于杜长大猪，说明晋汾白猪和杜长大猪不同部位骨骼肌剪切力的变化趋势并不一致。

不同猪种骨骼肌中4种类型肌纤维的含量及其标记基因的表达量都具有较大的差异。与国外猪种相比，中国地方猪的骨骼肌中氧化型肌纤维含量较多，酵解型肌纤维较少[20]。刘凡等[21]研究发现，12月龄林芝藏猪背最长肌中Ⅱa型肌纤维标记基因的表达量显著高于大白猪，而Ⅱb型肌纤维标记基因的表达量显著低于大白猪。Guo等[22]研究发现，6月龄马身猪背最长肌中Ⅰ和Ⅱa型肌纤维标记基因的表达量显著高于大白猪，而Ⅱb和Ⅱx型肌纤维标记基因的表达量显著低于大白猪。Hu等[23]研究发现，莱芜猪背最长肌Ⅱb型肌纤维标记基因的表达量显著低于杜洛克猪，而Ⅱa型肌纤维标记基因的表达量显著高于杜洛克猪。对于动物个体而言，不同部位骨骼肌的肌纤维组成也不同。 杨秋梅[14]通过组织切片和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸四唑氧化还原酶染色法发现，6月龄杜长大猪的背最长肌、半膜肌与半腱肌中Ⅰ型肌纤维的比例分别为10.00%、31.22%和45.44%，Ⅱa型为7.90%、15.56%和15.49%，Ⅱb型为82.03%、53.22%和39.01%，其中背最长肌中Ⅱb型肌纤维的含量显著高于半腱肌，Ⅰ、Ⅱa型肌纤维的含量均显著低于半腱肌。本研究中，马身猪背最长肌和趾长伸肌中Ⅰ与Ⅱa肌纤维标记基因的表达量显著高于杜长大猪，Ⅱb型肌纤维标记基因的表达量显著低于杜长大猪；培育品种晋汾白猪的背最长肌Ⅰ型肌纤维标记基因的表达量低于杜长大猪，Ⅱb型肌纤维标记基因的表达量没有明显差异；而趾长伸肌Ⅰ型肌纤维标记基因的表达量显著高于杜长大猪，Ⅱb型肌纤维标记基因的表达量显著低于杜长大猪，两个部位骨骼肌的Ⅰ和Ⅱb型肌纤维标记基因的表达量并不一致，背最长肌氧化型肌纤维标记基因的表达量显著高于趾长伸肌，而酵解型标志基因的表达量较低。

骨骼肌运动所需ATP的生成方式有2种：糖酵解和氧化磷酸化。葡萄糖通过糖酵解代谢分解为丙酮酸，同时产生少量的ATP。乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）可以催化丙酮酸生成乳酸，其含有2个亚基：LDHA和LDHB。丙酮酸也可以生成乙酰辅酶A，通过三羧酸循环和氧化磷酸化产生大量的ATP。氧化磷酸化发生在线粒体中，主要包括呼吸电子传递链过程中形成的质子电化学梯度和质子电化学梯度驱动ATP合酶合成的ATP。不同猪种骨骼肌中糖酵解和氧化磷酸化的活性存在较大差异。Chen等[24]研究发现，巴马猪背最长肌中LDH活性显著低于大白猪，而琥珀酸脱氢酶（SDH）与苹果酸脱氢酶（MDH）活性均显著高于大白猪。Lefaucheur等[25]研究发现，巴斯克猪半膜肌中LDH活性显著低于大白猪，而柠檬酸合酶（CS）和β-羟基酰基辅酶A脱氢酶（HAD）活性均显著高于大白猪。本研究中，马身猪和晋汾白猪骨骼肌中LDHA和LDHB基因的表达量均显著低于杜长大猪，而ATP5A1和SDHA基因的表达量均低于杜长大猪。本研究结果与前人报道并不一致，可能原因是猪ATP5A1和SDH通过改变蛋白的含量和空间构象来调控其生物学活性，mRNA的表达量并不能真实反映ATP5A1和SDH酶的活性。Huber等[26]研究发现，猪背最长肌中LDH的活性显著高于膈肌，而异柠檬酸脱氢酶（ICDH）活性显著低于膈肌。本研究发现，趾长伸肌中LDHA、LDHB和ATP5A1基因的表达量均高于背最长肌，SDHA基因的表达量低于背最长肌。说明不同部位骨骼肌的糖酵解和氧化磷酸化活性也存在较大差异。

4 结 论

3个猪种相比，马身猪骨骼肌肌纤维直径和横截面积较小，Ⅰ和Ⅱa型肌纤维标记基因的表达量高；杜长大猪骨骼肌Ⅱb型肌纤维标记基因的表达量高，氧化磷酸化和糖酵解相关基因的表达量均较高。