正畸联合牙周治疗基于OPG/RANK/RANKL通路对牙周炎模型大鼠的干预作用▲

王晓忠 姬小婷

(1 陕西省咸阳市中心医院口腔科，咸阳市 712000，电子邮箱：mjlr05@163.com；2 陕西中医药大学附属医院口腔科，咸阳市 712000)

牙周炎是一种常见的牙科疾病，主要是由细菌感染造成，因此抑制牙周致病菌成为治疗牙周炎的关键。目前临床上，通常采用机械去除牙菌斑和牙结石，同时使用抗生素治疗牙周炎[1-2]。牙周正畸治疗是恢复正常咬合功能及牙周组织功能的重要手段，对维持牙周组织健康具有重要意义。正畸过程中使用种植体支抗，能够有效保证牙齿移动支抗的重组，还能避免牙齿移动导致的牙周反应，保护牙周组织[3]。张瑞林等[4]的研究表明，在正畸过程中，核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)/骨保护素(osteoprotegerin，OPG)的表达呈现出不同变化，同时伴随关键细胞凋亡分子的表达变化，且与牙槽骨改建和牙齿移动的关系密切。本研究通过检测OPG/核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor κB，RANK)/RANKL通路蛋白表达,分析正畸联合牙周治疗对牙周炎模型大鼠的干预效果及机制，为临床上牙周炎的治疗提供新方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选取51只8周龄雄性SD大鼠[陕西省食品药品检验研究院，使用许可证号：SYXK(陕)2018-002]，体重180～220 g，分笼饲养，自由摄食饮水，饲养温度22℃～25℃，室内湿度35%～40%，饲养室定时进行紫外线照射消毒。统一给予标准饲料喂养，允许大鼠自由活动，饲养时间为1周。本研究已获得我院医学伦理委员会批准。将51只大鼠随机分为对照组、模型组、观察组，各17只。对照组不建模且不给予治疗措施；模型组参照文献[5]建立牙周炎模型，但不给予正畸与牙周治疗；观察组参照文献[5]建立牙周炎模型，并给予正畸与牙周治疗。

1.2 实验方法

1.2.1 建模：使用20%戊巴比妥钠(1 mL/kg)腹腔注射对大鼠进行麻醉，麻醉满意后将大鼠左上颌第1磨牙牙周与牙根面进行分离，使用正畸钢丝结扎牙颈部；麻醉苏醒1 d后给大鼠喂养高糖饲料(包括酵母粉5 g、肝粉2 g、脂奶粉30 g、200 g/L的高糖水30 mL)及少量的食盐和蔬菜，持续喂养4周后检测探针深度，达到2 mm以上说明牙周炎模型建模成功，所有模型组及观察组大鼠均成功建模。

1.2.2 牙周治疗：在建模成功后，通过腹腔注射20%戊巴比妥钠(1 mL/kg)麻醉观察组大鼠。麻醉成功后将大鼠仰卧固定，结扎左上颌第1磨牙牙颈部，做第1磨牙牙周改良切口(内斜+垂直+附加切口，改良切口可以充分暴露病损区，减少术后牙龈退缩，利于牙周组织再生)，采用微创技术对牙周改良切口进行翻瓣，完全暴露病变区，去除炎性组织，修整内壁，并使用生理盐水冲洗3次，1 min/次。术后按5 mL/kg肌肉注射庆大霉素注射液进行抗感染治疗，1次/d，连续3 d，自由进食。

1.2.3 正畸装置佩戴并加力：在牙周治疗结束1周后，观察组采用种植体支抗内收切牙进行治疗。同法麻醉观察组大鼠后，将其仰卧固定，于大鼠左上颌第1磨牙处手动旋入微螺钉种植体(厂家：台湾亚太医疗公司)。植入后即刻佩戴正畸装置[厂家：托博正畸器械(无锡)有限公司]并加力。将镍钛拉簧固定于微螺钉种植体处，使用正畸测力装置测量螺旋拉簧的力量，力值为50 g，内收切牙。干预28 d。

1.2.4 HE染色：于加力3 d、28 d后采用抽签法随机取各组2只大鼠牙周组织，使用10%甲醛溶液固定1 d，并使用10%乙二胺四乙酸进行脱钙处理，12 d后取出进行梯度乙醇脱水处理，石蜡包埋，切片后进行HE染色。

1.2.5 菌斑指数、牙周探诊深度、龈沟出血指数检测：于干预前、干预结束3 d后检测各组大鼠菌斑指数、牙周探诊深度、龈沟出血指数。其中，菌斑指数0分指牙龈边缘区无菌斑；1分指牙龈边缘区有薄菌斑，可以忽略；2分指牙龈边缘区菌斑覆盖中等；3分指牙龈边缘及邻近部位菌斑覆盖量大。龈沟出血指数1分指大鼠有轻度炎症，龈沟无出血；2分指大鼠有点状出血；3分指大鼠牙龈有出血但不溢出；4分指大鼠牙龈有血溢出；5分指大鼠牙龈明显肿胀，自动出血。

1.2.6 白细胞介素8、骨形态发生蛋白2水平的检测：于干预前、干预结束3 d后，抽取大鼠尾静脉血3 mL，采用酶联免疫吸附法检测白细胞介素(interleukin,IL)-8、骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)水平。试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司(批号：20180201、20180601)，严格按照说明书步骤进行操作。

1.2.7 OPG/RANK/RANKL蛋白表达水平的检测：采用蛋白印迹法检测OPG、RANK、RANKL蛋白的表达水平。于干预结束3 d后取各组大鼠尾静脉血3 mL，4℃、2 500 r/min离心处理10 min，取出上清液，采用二喹啉甲酸蛋白浓度测定试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，批号：20180501)检测蛋白含量。将50 μg蛋白加入十二烷基硫酸钠凝胶加样缓冲液中，100℃加热处理5 min促使蛋白变性。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳完成后进行转膜，结束后取下硝酸纤维素膜，在5%脱脂牛奶中4℃封闭1 h，封闭结束后，加入OPG、RANK、RANKL一抗(厂家：北京义翘神州科技股份有限公司；批号：11682-R001、16078-T48、11682-T16；稀释比例均为1 ∶1 000)，使用0.05%～0.1% TBST进行稀释，4℃孵育过夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST洗膜3次，5 min/次，加入羊抗鼠二抗(厂家:深圳市安提生物科技有限公司；批号：AT01IgGAb、AT01Vb2Ag、AT01Vb6Ab；稀释比例均为1 ∶1 000)，温室孵育1 h，TBST洗膜3次，5 min/次。采用二氨基联苯胺染色试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，批号：20180102)显色，使用IPP软件扫描灰度值，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因为内参，计算目的蛋白的相对表达水平。

1.3 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，组内前后比较采用配对t检验，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠建模后牙周组织病理变化 对照组大鼠牙龈上皮及上皮钉突未见明显异常，胶原纤维排列有序，无炎症浸润；模型组大鼠上皮钉突增生，牙周组织胶原纤维排列紊乱，牙周韧带排列紊乱，较多炎性细胞浸润，结缔组织表面可见骨吸收陷窝和破骨细胞。进一步确诊为重度牙周炎，提示模型建立成功。见图1。

对照组 模型组

在观察组中，加力3 d后可见成纤维细胞增多、少量成骨细胞及压力侧破骨细胞；加力28 d后压力侧牙周膜缩小变窄，牙周胶原纤维排列不整齐，可见大量骨吸收陷窝及破骨细胞，血管扩张，可见新生成牙骨质细胞。见图2 。

加力3 d后 加力28 d后

2.2 3组大鼠牙周探诊深度、菌斑指数和龈沟出血指数的比较 干预前，模型组和观察组大鼠的牙周探诊深度、菌斑指数、龈沟出血指数均较对照组增加(均P<0.05)。干预后，模型组上述指标与干预前比较差异无统计学意义(均P>0.05)，且仍较对照组增加(均P<0.05)，而观察组上述指标均较干预前改善，且优于模型组(均P<0.05)。见表1。

表1 两组大鼠牙周探诊深度、菌斑指数和龈沟出血指数指标的比较(x±s)

2.3 3组大鼠血清IL-8、BMP-2水平的比较 干预前，模型组和观察组大鼠的血清IL-8和BMP-2水平均高于对照组(均P<0.05)。干预后，模型组上述指标与干预前比较差异无统计学意义(均P>0.05)，且仍高于对照组(均P<0.05)，而观察组上述指标均较干预前降低，且低于模型组(均P<0.05)。见表2。

表2 3组大鼠血清IL-8、BMP-2水平的比较(x±s,μg/L)

2.4 3组大鼠血清OPG、RANK、RANKL蛋白相对表达水平的比较 干预后，模型组、观察组大鼠血清OPG、RANKL蛋白相对表达水平低于对照组，血清RANK蛋白相对表达水平高于对照组(均P<0.05)；观察组大鼠血清OPG、RANKL蛋白相对表达水平高于模型组，血清RANK蛋白相对表达水平低于模型组(均P<0.05)。见表3和图3。

表3 3组大鼠血清OPG、RANK、RANKL蛋白相对表达水平的比较(x±s)

图3 各组大鼠血清OPG、RANK、RANKL蛋白表达水平

3 讨 论

部分牙周炎患者会出现前牙位移的情况，导致牙周袋深度增加，从而出现牙齿松动、间隙加宽等问题[6]。左常艳等[7]的研究表明，牙周组织再生术联合正畸治疗牙周炎的效果确切，能够有效改善患者的牙周状况，降低并发症发生率，提高患者的牙齿美观度，值得临床推广。

正畸牙移动指通过机械力的作用使牙周组织在生理限度内发生改变，进而使牙齿向预定的方向移动，这一过程主要依赖于牙周组织的改建[8-9]。有研究表明，正畸牙移动是炎性反应的过程[10]。在正畸过程中，纤维应力刺激成骨细胞和破骨细胞的生长，并促进多种生长因子分泌，控制牙槽骨的形成和吸收，进而达到矫治的目的。微螺钉种植体具有创伤性较小、操作简便、即刻负载等优点[11-12]。微螺钉种植体的加力包括即刻加力和延迟加力，目前临床上通常采用即刻加力，其能够有效满足支抗要求，200 g以内的加力不会引起种植体移动，不影响临床应用[13-14]。本研究结果显示，干预后观察组大鼠的牙周探诊深度、菌斑指数、龈沟出血指数均较干预前改善，且优于模型组(P<0.05)，提示在牙周治疗的基础上旋入微螺钉种植体后即刻佩戴正畸装置并加力，能改善牙周炎大鼠牙龈边缘区菌斑和出血状况，抑制微生物产生、细菌定植和生存，从而改善牙周炎所引起的症状。

IL-8属于趋化因子家族的成员，其主要由单核巨噬细胞分泌，能激活中性粒细胞，释放一系列活性产物，导致机体发生炎症反应，进而引起细胞损伤[15-17]。解健等[18]的研究表明，BMP-2同轴纳米纤维膜能够有效抑制牙周炎相关炎性因子的表达，促进成骨细胞标志基因的表达，对病变骨缺损具有一定的修复作用。本研究结果显示，干预后观察组大鼠血清IL-8、BMP-2水平均较干预前降低，且低于模型组(P<0.05)，说明微种植体引起的大鼠机体炎症反应程度较轻且能诱导牙周膜间充质细胞的分化，从而促进牙周膜修复。

OPG、RANK、RANKL均是促进破骨细胞分化的重要因子，也是调节骨吸收的重要因子。RANKL属于肿瘤坏死因子家族中的一员，主要以RANK配基、重组人可溶性RANKL两组形式存在，两者均具有较强的促破骨细胞分化和骨吸收作用，但RANK配基促进破骨细胞分化和骨吸收的作用较强[19]。RANK主要在破骨细胞前体和成熟的破骨细胞表面表达[20]。OPG也属于肿瘤坏死因子家族中的一员，是一种可溶性糖蛋白，由400多个氨基酸组成[21]。本研究结果显示，干预后，观察组大鼠血清OPG、RANKL蛋白相对表达水平低于对照组，但高于模型组，血清RANK蛋白相对表达水平高于对照组，但低于模型组(P<0.05)。这说明在牙周治疗的基础上采用旋入微螺钉种植体后即刻佩戴正畸装置并加力，可能是通过调控OPG/RANK/RANKL通路蛋白的表达，以促进成骨细胞分化与骨吸收，从而起到治疗牙周炎的作用。这与贺志强等[22]的研究结果相似。

综上所述，正畸联合牙周治疗能够有效调控牙周炎大鼠体内OPG/RANK/RANKL蛋白表达，减轻炎症反应，促进牙周膜修复，从而起到治疗牙周炎的作用，这为临床治疗牙周炎提供了理论依据。