SGLT2抑制剂达格列净对糖尿病肾病的保护机制研究

曹雨琛，李成强，刘鉴颖，宋 葳，孙昕昳

(北华大学附属医院，吉林 吉林 132011)

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的主要慢性并发症之一，是终末期肾衰竭的主要原因，目前尚无有效的治疗方法.钠-葡萄糖共转运蛋白2(Sodium-glucose cotransporter 2，SGLT2)是钠-葡萄糖共转运蛋白家族中的一种[1]，主要分布肾脏近曲小管，介导葡萄糖的重吸收.SGLT2抑制剂代表药物达格列净是一种新型降糖药，它的作用机制是通过抑制肾脏近曲小管对葡萄糖的重吸收，使过量的葡萄糖从尿中排出，导致血糖降低.目前有研究[2]表明：SGLT2i达格列净不仅可以降低血糖，还对DN有保护作用，但具体机制尚未明确.DN的发病机制比较复杂，目前公认与肾脏血流动力学改变、氧化应激、糖代谢异常、遗传易感性及细胞凋亡等关系密切[3-6]，SGLT2i达格列净在DN中与细胞凋亡关系尚未阐明.内质网应激(Endoplasmic reticulum stress response ERS)途径是细胞凋亡途径之一，Caspase12蛋白是ERS特有的凋亡蛋白，因此，本研究通过SGLT2i达格列净作用于db/db小鼠DN模型，观察SGLT2i达格列净对DN的影响，并进一步探讨其保护机制.

1 材料与方法

1.1 动 物

选用雄性db/db小鼠(平均6周龄，体质量(55±10)g；n=21)和雄性wt小鼠(平均6周龄，体质量(26±1)g；n=20)，均由南京生物医药研究院实验中心提供.所有小鼠饲养在室温(20±1) ℃、12 h光照/12 h暗周期下，投喂普通饲料(中国北京奥谢利饲料有限公司)和干净水.在实验开始前，先适应性喂养2周，观察小鼠自然情况，小鼠适应后开始制模喂养4周，期间测量小鼠的体质量、血糖，留取24 h蛋白尿、UACR、血肌酐，并于4周末随机抽取1只db/db小鼠做肾脏病理，确定小鼠DN改变.DN模型制作成功后，将wt组小鼠随机分为wt组、wt+SGLT2i组，将DN模型的db/db小鼠随机分为db/db组、db/db+SGLT2i组，共4组，每组10只.其中wt+SGLT2i组、db/db+SGLT2i组小鼠用生理盐水溶解达格列净(10 mg/片)，按1 mg/(kg·d-1)灌胃，wt组和db/db组小鼠按100 μL/10 g生理盐水灌胃，均1次/d，连续12周，期间测量小鼠体质量、血糖、UACR、24 h尿蛋白、血肌酐，并在第12周末取材.

所有动物程序均经北华大学机构动物保护和使用委员会批准，小鼠严格按照《医学实验动物保护和使用指南 》(中华人民共和国卫生部，2011年)和《北华大学实验动物伦理标准指南》进行处理.

1.2 方 法

取材时，用冰生理盐水冲洗肾脏，然后称重.通过比较肾脏湿质量和体质量来评估肾脏肥大指数.应用尿液分析试纸条(干化学法)检测UACR，应用ELISA 法检测24 h蛋白尿和血肌酐.

病理检查：收集各组小鼠肾组织，用40 g/L多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，3～4 μm厚切片，苏木素伊红染色.

透射电子显微镜：肾皮质用2%戊二醛固定在4 ℃的碳酸氢盐缓冲液中，后固定在1%四氧化二钐中，用2%醋酸铀酰染色，将样品脱水并包埋在Poly/Bed 812 Araldite树脂中.超薄切片(50～100 nm)用超微切割机切割，安装在铜网上，用Tecnai10透射电子显微镜(飞利浦公司，荷兰)检查.使用Megaview G2 CCD相机(明斯特软成像系统有限公司，德国)在6 200倍的放大率下拍摄数字图像.

免疫组织化学染色：肾组织用40 g/L多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，3～4 μm厚切片，脱蜡后用3%过氧化氢甲醇溶液室温封闭内源性过氧化物酶30 min.应用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)与2%牛血清白蛋白预孵育30 min以阻断非特异性反应，与兔抗人Caspase12多克隆抗体以1∶400倍稀释，4 ℃孵育过夜(香港Abcam公司).切片用PBS洗涤，结合抗体用SP1试剂盒(北京中山金桥生物科技有限公司)检测，在0.05% 3，3-二氨基联苯胺和0.03% H2O2中可见免疫反应产物.切片后用苏木精反染、脱水、清除、计数，在奥林巴斯BX51显微镜(奥林巴斯公司，日本)下观察.在对照染色中，切片与山羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)孵育(香港Abcam公司).

Western blot分析：肾组织匀浆于RIPA缓冲液50 mmol Tris-HCl(pH 7.5，含有150 mmol NaCl、1 mmol Na2EDTA、1 mmol EDTA、1%Triton、2.5 mmol焦磷酸钠、1 mmol β-甘油磷酸钠、1 mmol Na3VO4、1 mmol NaF、1 μg/mL亮肽素和1 mmol PMSF(南京Beyotime生物技术研究所))中提取总蛋白.将均质样品煮沸5 min，在-20 ℃保存，应用皮尔斯生物化学试剂盒(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)测定蛋白质浓度.蛋白质印迹分析中蛋白裂解产物(30～50 μg)用12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Beyotime Institute Of Biotechnology)溶解，然后转移到P膜上(马萨诸塞州波士顿米利波尔公司，美国).用5%脱脂奶粉在缓冲液(10 mmol Tris-HCl(pH 7.6，含有100 mmol NaCl、0.1%Tween 20)中室温封闭2 h，然后分别与一抗兔抗Caspase12(Abam公司，美国)、鼠抗β-肌动蛋白的单克隆抗体(Abam公司，美国)1∶1 000稀释，4 ℃过夜，与辣根过氧化物酶标记的二抗(杭州华安生物科技有限公司)在1∶2 000倍稀释下室温孵育1.5 h.免疫反应条带用3，3-二氨基联苯胺(Sigma-Aldrich公司，德国)显影.应用Tanon GIS凝胶成像仪(中国Tanon科技股份有限公司)测量并分析具有代表性的波段.蛋白质水平归一化为β-肌动蛋白，比值表示为3个独立实验的均数±标准差.使用Quantity One 1-D软件通过密度计量法对蛋白质水平进行量化.应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)根据检测试剂盒(罗氏公司，美国)说明书进行细胞凋亡检测.具体方法：将切片充分脱蜡和水化，脱蜡20 min(60 ℃)，再用二甲苯浸洗2次(5 min)，用梯度酒精从高浓度到低浓度浸洗，达到水化；再浸入4%多聚甲醛15 min，PBS浸洗2次；然后应用蛋白酶K孵育20 min，延长1 h TUNEL反应液的时间；PBS清洗5次，DAB显色10 min.随机选择6个实验组，计数具有特征性核碎裂(绿色染色)的凋亡细胞.实验重复3次.

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 SGLT2i对db/db小鼠肾损伤的影响

实验结果显示：与wt组比较，db/db小鼠DN组血糖、肾质量/体质量比、血肌酐、24 h尿蛋白及UACR均明显升高，而体质量明显降低(P<0.05).与db/db组比较，db/db+SGLT2i组UACR、24 h尿蛋白、血肌酐及血糖水平明显降低(P<0.05)，体质量也有所减轻，但肾质量/体质量比值无明显变化(见图1 a～f).组织病理学结果显示：与wt组比较，db/db组肾小球鲍曼间隙缩小，肾小球基底膜增厚，系膜基质扩张，系膜细胞增生(P<0.05).与db/db组比较，db/db+SGLT2i组上述病理改变均减轻(P<0.05，见图1 g).透射电镜观察肾脏的超微结构结果显示：与wt组比较，db/db组肾小球基底膜增厚，膜滤过层结构不清，足细胞足突紊乱，间隙增宽，系膜基质增多(P<0.05).与db/db组比较，db/db+SGLT2i组的上述情况明显减轻(P<0.05，见图1 h)，表明SGLT2i达格列净可以减轻db/db小鼠的肾脏损伤.

*.wt与db/db组比较P<0.05；db/db组与db/db+SGLT2i组比较P<0.05.a～f wt组、wt+SGLT2i组、db/db组和db/db+SGLT2i组小鼠的体质量、血糖、肾质量/体质量、24 h尿白蛋白、肌酐及UACR的数值；g 苏木精-伊红染色；h 组织病理学.图1 SGLT2i达格列净对糖尿病肾病小鼠肾脏损伤的影响Fig.1 Effect of SGLT2i Dapagliflizin on renal injury in db/db mice with diabetic nephropathy(×400)

2.2 SGLT2i达格列净对db/db DN小鼠模型的细胞凋亡及ERS途径相关蛋白Caspase12蛋白表达的影响

实验结果显示：和wt组比较，db/db DN组小鼠肾小管上皮细胞凋亡明显升高；和db/db组比较，db/db+SGLT2i组细胞凋亡明显降低(见图2 a).此外，分别利用免疫组化和Westernblot法检测内质网应激相关蛋白Caspase12蛋白，结果显示：与wt组比较，db/db组小鼠的Caspase12蛋白表达明显升高；与db/db组比较，db/db+SGLT2i组Caspase12蛋白表达明显降低(图2 b～c).

*.P<0.05.a TUNEL染色及细胞凋亡情况；b 免疫组化法观察各组Caspase12蛋白的表达(×200)；c Western blot法观察各组Caspase12蛋白的表达图2 SGLT2i达格列净对DN小鼠肾小管的细胞凋亡及减轻内质网应激相关Caspase12蛋白表达的影响Fig.2 Effect of SGLT2i Dapagliflizin on renal tubular apoptosis and expression of endoplasmic reticulum stress-related Caspase12 protein in db/db mice with diabetic nephropathy

3 讨 论

随着社会的发展及人口老龄化、生活方式等改变，糖尿病(Diabetes mellitus，DM)患病率急剧上升.根据流行病调查，我国2型糖尿病发病率高达到11.6%[4]，DM所产生的并发症也随之增加，因此，DM已成为全世界共同面临的健康问题.

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是DM最主要的并发症之一，也是终末期肾病(End stage renal disease，ESRD)的主要病因，随着DM发病率的增高，DN发病率也比过去10 a增加了两倍以上，占所有ESRD的50%[5].DN导致患者生活质量下降，所以，防治DN成为治疗DM的关键之一.但是DN发病机制复杂，目前认为与肾脏血流动力学改变、糖代谢异常、氧化应激、异常免疫、遗传因素等相关[3，6].随着研究的深入，人们发现DN也与细胞凋亡关系密切[7].细胞凋亡途径之一是内质网应激途径(Endoplasmic reticulum stress response，ERS)，Caspase12蛋白是ERS特有的凋亡蛋白.本研究结果显示：与db/db DN组比较，db/db组Caspase12蛋白表达明显增高，提示DN时，Caspase12蛋白能够激活ERS凋亡途径.其他研究[8-9]表明，DN时Caspase12蛋白表达上调，对DN有损害作用；LIU等[10]研究也提示，Caspase12蛋白表达下调对DN有保护作用.SGLT2是钠-葡萄糖转运载体家族(Sodium-dependent glucose transports SGLTs)中的一种单体，它可以高选择性作用于肾脏近曲小管，促进葡萄糖的重吸收.SGLT2抑制剂(SGLT2i)代表药达格列净(Dapagliflozin)是一种新型降糖药，它通过抑制肾脏近曲小管对葡萄糖的重吸收，使过量的葡萄糖从尿液中排出，从而降低血糖.随着研究的深入，人们发现SGLT2抑制剂不仅有降低血糖作用，还有降低血压、降低心血管终点事件、减重、保护胰岛β细胞功能等作用，也对DN有一定的保护作用[11].但SGLT2i达格列净对DN保护作用的具体机制尚不明确.本研究结果证实：SGLT2i达格列净可以减少db/db小鼠的24 h蛋白尿及UACR(见图1 d)，肾脏病理提示SGLT2i达格列净可以减轻缩小的肾小球鲍曼间隙、增厚的肾小球基底膜、扩张的系膜基质以及增生的系膜细胞(见图1 g).电镜结果显示：SGLT2i达格列净可以减轻足细胞足突的紊乱(见图1 f)，提示SGLT2i达格列净对肾脏有保护作用.SHIN SJ等[12]的研究也显示：SGLT2i达格列净对DN有保护作用，其作用机制是通过减轻肾脏氧化应激、减轻炎症反应实现的.有研究[13]应用SGLT2i恩格列净治疗db/db鼠，发现肾小球损伤也得到改善，其机制与减轻炎症和纤维化有关.SGLT2i鲁格列净治疗糖尿病小鼠后可以延缓DN晚期eGFR的进行性下降，从而减少肾小球屏障损伤和肾纤维化程度[14].SGLT2i伊格列净和依帕列净通过改善糖尿病脂质代谢紊乱、减少全身氧化应激和炎症，从而减少肾脏损伤[15-16].细胞凋亡是DN的发病机制之一[17]，我们的前期研究[18]结果也发现：DN时，细胞凋亡增加，并且细胞凋亡途径之一的ERS相关蛋白Caspase12表达上调，下调Caspase12蛋白的表达对DN有保护作用[19]，LIU Tingting等[20]也有同样的研究结果.本研究发现：SGLT2i达格列净可以减少肾小管上皮细胞的细胞凋亡(见图2 a)，并且使ERS相关蛋白Caspase12的表达下调(见图2 b～c)，因此，我们认为SGLT-2i达格列净对DN有保护作用其可能的机制与改善ERS细胞凋亡途径有关.由于ERS途径有3条主要信号转导途径，具体与哪条信号转导途径有关目前还不明确，今后将在我们的实验研究中进一步阐明.

综上所述，本实验从细胞凋亡角度证实了SGLT2i达格列净对DN的影响，这为SGLT2i达格列净对DN具有保护作用提供了实验室依据.