蛋白激酶C调节疼痛的神经免疫细胞机制研究进展

刘双双，袁杰，秦榜勇

(遵义医科大学附属医院疼痛科，贵州 遵义 563000)

慢性疼痛是一个严重的公共卫生问题，影响患者的生活质量，并导致重大的社会经济负担。慢性疼痛通常可分为慢性癌症相关疼痛和慢性非癌症相关疼痛，如慢性神经性疼痛和慢性手术后或创伤后疼痛[1]。尽管许多研究阐明了慢性疼痛发展的潜在机制，但目前只有少数临床药物能有效缓解患者的疼痛症状，且有一定的不良反应。因此，探索治疗慢性疼痛的新靶点势在必行。

先前的研究表明，疼痛尤其是神经病理性疼痛潜在的病理生理学包括外周和中枢敏化[2]。结构变化、许多细胞间相互作用和分子信号传递是伤害感受途径敏感化的基础。另外，还包括离子通道的改变、免疫细胞的激活、神经胶质源性介质和表观遗传调节[3]。研究发现，蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)分布于疼痛调节的关键部位，并且其多种亚型参与疼痛的调节，在慢性疼痛的发展中还具有调节神经免疫的作用[4-5]。外周损伤部位和中枢神经系统PKC通过多途径调节中性粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞的功能，介导施万细胞和神经元活性调节，参与中枢小胶质细胞和星形胶质细胞的炎症反应，在神经元和非神经元之间疼痛的信息传递中起重要作用。现就PKC调节疼痛的神经免疫细胞机制进行综述，以为疼痛的治疗提供新见解。

1 PKC的概述

PKC是一种广泛分布在哺乳动物真核细胞的钙/磷依赖性蛋白激酶，哺乳动物中至少存在10个不同的基因，编码不同的PKC亚型。目前已知的PKC分为3种亚型：经典型PKC(α、βⅠ、βⅡ、γ)，对钙和二酰甘油依赖；新型PKC(δ、ε、η、θ)，对钙不依赖但对二酰甘油依赖；非经典型PKC(ζ和ι/λ)，对钙和二酰甘油不依赖。多种胞外信息分子与它们各自的受体结合时会激活磷脂酶C家族的成员，随后膜相关磷脂酶C的激活导致质膜上4，5-酯酰肌醇二磷酸水解成1，4，5-肌醇三磷酸和二酰甘油，肌醇三磷酸反过来触发内质网中钙的释放，导致细胞溶质钙浓度升高。二酰甘油和钙水平的升高导致PKC的激活并使其从细胞溶质到质膜以及到其他亚细胞位置，PKC对调节多种神经元功能尤为重要，对许多参与伤害感受的离子通道具有致敏作用[6]。PKC在静息状态下以无活性形式存在于胞质中，激活后转位于细胞膜，通过磷酸化作用，在信号转导过程中充当第二信使。磷酸化的PKC降低内质网Ca2+-ATPase的功能，抑制Ca2+进入内质网。同时，磷酸化的PKC激活肌醇三磷酸受体，允许Ca2+流出内质网，导致内质网钙离子浓度下调，然而钙通道开放引起Ca2+的流入和胞质内Ca2+的上调。细胞内Ca2+上调可进一步激活初级感觉神经元瞬时受体电位通道蛋白(transient receptor potential channel protein，TRP)A1、TRPV1等受体，导致外周致敏的形成[7]。

蛋白质磷酸化构成了疼痛信号通路中重要的转录后调节机制，目前认为PKC主要与慢性疼痛的细胞磷酸化和信号转导机制有关[8]。研究发现，在慢性偏头痛大鼠模型中，PKC促进N-甲基-D-天冬氨酸-2B受体蛋白磷酸化，参与代谢型谷氨酸受体5对突触可塑性的调节，导致疼痛的中枢敏化[9]。此外，PKC在正常大鼠和神经病理性疼痛大鼠杏仁核的伤害性调节中起重要作用，杏仁核内注射PKC抑制剂抑制了甘丙肽诱导的抗伤害感受，进一步研究发现杏仁核PKC不仅参与调节疼痛，也调节压力和情绪[10]。在外周神经系统，PKC是TRPV1的激活和脱敏的关键调节因子[11]，TRPV1在调节慢性疼痛及免疫细胞活化和细胞因子产生方面发挥重要作用[12]。研究表明，多种PKC亚型的激活与持续疼痛条件下外周和(或)中枢敏化等有关，Sweitzer等[13]研究发现PKCγ和PKCε参与甲醛诱导的伤害感受，Bhatt等[14]证明PKCδ抑制剂可减弱肽聚糖诱导的诱导型一氧化氮合酶表达和一氧化氮释放。大鼠背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)PKCα和PKCε通过磷酸化参与完全弗氏佐剂诱导的炎症，PKCε参与前列腺素E2对疼痛的调节作用，PKCα还在嘌呤能受体P2X3介导的炎症后痛觉过敏中起重要作用[15-16]。关于PKC在疼痛中的研究逐渐增多，需进一步研究和探讨其在疼痛中的神经免疫调节作用，以期成为治疗疼痛的一个重要靶点。

注:Pain为疼痛，Brain为大脑，PLC为磷脂酶C，IP3为1，4，5-三磷酸肌醇，DAG为二酰甘油，PKC为蛋白激酶C，Microglia为小胶质细胞，Astrocyte为星形胶质细胞，Spinal cord为脊髓，Iummne cell为免疫细胞，IL-5为白细胞介素-5，5-HT为5-羟色胺，Histamine为组胺，NGF为神经生长因子，LTB为白三烯B，TNF-α为肿瘤坏死因子-α，Schwann cell为施万细胞，Hurt为伤害性刺激

2 免疫细胞PKC介导疼痛的神经炎症反应

疼痛是一种与实际或潜在的组织损伤相关的不愉快的感觉和情绪情感体验，或与此相似的经历[17]。在过去20年里，疼痛神经免疫学相关研究在所有疼痛研究中的比例增加了近2倍[18]，疼痛的神经免疫机制有利于揭示伤害性疼痛向慢性疼痛的转变，神经免疫学可能是解释疼痛的关键所在，因此是当前重要的研究方向。大脑和脊髓中免疫细胞之间的信号传递是调节慢性疼痛的关键因素，并且与遗传易感性有关，Arman等[19]研究认为，能够实现在大鼠脊髓鞘内对白细胞介素(interleukin，IL)-1β的监测以阐明神经痛时脑内免疫信号的实时变化。另有研究认为，在疼痛的传导部位神经损伤引起免疫细胞和胶质细胞的反应不同：巨噬细胞和施万细胞促进神经损伤远端神经纤维的沃勒变性；巨噬细胞、淋巴细胞和卫星细胞驱动DRG的免疫反应；脊髓小胶质细胞的激活则介导中枢神经系统对周围神经损伤的早期反应，随后星形胶质细胞激活并增殖。初级感觉神经元、施万细胞和免疫细胞之间形成疼痛调节的复杂网络，而细胞因子和多种趋化因子是其核心成分[20]。若能较好地阐明疼痛的神经免疫学机制或将为疼痛治疗提供新的靶点。

文献报道，PKC在中枢和外周神经系统中具有抗伤害性作用，单纯疱疹病毒介导IL-10的表达降低了PKC磷酸化水平，同时增加了糖尿病大鼠DRG神经元的细胞完整性，减少了糖尿病大鼠DRG中促炎细胞因子(如Toll样受体4)的表达，由此也能看出PKC具有参与调节“神经免疫”反应的作用，可通过神经免疫机制阻断DRG神经元的伤害反应和应激反应[21]。在神经性疼痛条件下神经损伤部位、DRG和脊髓背角发生改变。在这些部位，内皮细胞损伤和神经元活动增加导致单核/巨噬细胞(外周)的招募和小胶质细胞(中央)的激活，小胶质细胞释放导致神经元敏感的介质，从而实现持续慢性疼痛的正反馈。

2.1损伤部位 免疫细胞接收并整合来自其外部环境及其微环境中的邻近细胞和细胞因子的信号，进而参与免疫反应。除了淋巴细胞参与慢性炎症过程外，中性粒细胞是外周组织损伤早期的主要免疫细胞，巨噬细胞、肥大细胞在炎症后期发挥更重要的作用。免疫细胞分泌如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、IL-1β、IL-6、神经生长因子、前列腺素E2、组胺、5-羟色胺、白三烯B4等炎症因子，导致神经元离子通道Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、TRPV1和TRPA1的磷酸化，使动作电位生成和伤害感受器敏感增加，使机体对感觉刺激做出更强烈的反应，并促进疼痛[22]。有研究认为，PKC能够与免疫细胞表面的受体发生物理联系，这些表面分子的触发会开启PKC和其他分子信号通路，进而诱发免疫细胞下游信号转导[23]。

中性粒细胞是人体最多的白细胞，当有炎症时，中性粒细胞被趋化因子CX3C配体1(chemokine CX3C ligand 1，CX3CL1)和白三烯B4吸引，作为第一个响应有害刺激而迁移到损伤部位的细胞，发挥清除碎片、招募单核细胞/巨噬细胞的功能[24-25]，在中性粒细胞中表达绝大多数的PKC亚类，PKC参与中性粒细胞还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的激活，生成的活性氧可以促进免疫细胞的聚集和增强炎症反应，还通过激活核因子κB通路调节炎症细胞因子和CX3CL1的表达，从而进一步促进免疫细胞的募集[26]。

肥大细胞是神经系统和免疫系统联系的桥梁，被激活的肥大细胞脱颗粒可释放炎症因子和CX3CL1等参与其他免疫细胞的募集和迁移。Madera-Salcedo等[27]认为，PKCδ和PKCβ通过磷酸化功能调节神经细胞和免疫细胞中突触体相关蛋白受体复合物形成，从而调控肥大细胞脱颗粒。研究表明，PKC参与对肥大细胞发挥效应功能的正向调节和负向调节，如PKCθ促进高亲和力IgE受体结合后肥大细胞在纤连蛋白表面的黏附和扩散，而PKCε抑制这一过程[23]。此外，肥大细胞释放组胺受PKCβ正向调节，但受PKCδ负向调节。

Zuniga等[28]证实PKCε参与巨噬细胞凋亡，介导巨噬细胞M1～M2亚型的极化，主要机制是PKCε调节还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶和活性氧产生，导致细胞功能障碍和加剧下游炎症。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子具有激活炎症细胞，刺激炎症相关因子分泌的作用。研究发现，PKC通过胞外信号调节激酶通路调节粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子表达[29-30]。长春新碱可诱导单核细胞/巨噬细胞和小胶质细胞表达CX3CL1受体，内皮细胞的激活也导致表达该受体的单核/巨噬细胞的募集，通过释放活性氧激活TRPA1通道，引起疼痛反应，从而使痛觉神经元敏感[31]。神经元表达释放CX3CL1，CX3CL1可增加病变处单核细胞、自然杀伤细胞和T淋巴细胞数量。CX3CL1与CX3CL1受体相互作用则激活小胶质细胞PKC信号通路，然后增加神经缺血状态下小胶质细胞中TNF-α和IL-1β的产生，促进炎症反应发生[31-32]。

Sorge等[33]发现淋巴结清扫可以明显减少选择性神经损伤大鼠星形胶质细胞激活，并减少活化的PKCγ兴奋性中间神经元数量。进一步研究发现，鸟嘌呤核苷酸交换因子DOCK8(dedicator of cytokinesis 8)是PKCα磷酸化的底物，DOCK8被磷酸化后进一步促进T细胞迁移，脊髓损伤后的T细胞促进中枢神经系统纤维化及自身免疫，进而介导中枢神经系统炎症[34]。脊髓损伤后B细胞促进自身免疫和脱髓鞘，PKCβ转运至B细胞抗原受体信号体时，募集IκB激酶α、IκB激酶β、IκB激酶γ/NEMO(核因子κB基本调制器)组成的IκB激酶复合物，通过核因子κB途径促进B细胞活化、增殖和存活，相反，PKCδ的触发却有利于通过胞外信号调节激酶途径导致B细胞凋亡[23]。

免疫细胞是炎症期间内源性阿片肽的主要来源，中性粒细胞、巨噬细胞等产生内源性阿片肽，如β-内啡肽、脑啡肽，后者与阿片受体结合调节疼痛[35]。吗啡对μ阿片受体的激活会进一步活化Gαi/o-Gβγ-PKCα磷酸化途径，该途径限制了μ阿片受体的分布，间接调节机体对疼痛的反应，研究发现该机制与PKC磷酸化μ阿片受体的Ser344、Ser363和Thr370等不同位点有关[36-37]。

总之，PKC在内皮细胞损伤后通过炎症因子的介导，参与中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等免疫细胞的招募及活化免疫细胞的相关功能，诱发免疫细胞下游信号转导及调节阿片受体活化，从而促进疼痛的发生发展。

2.2外周神经系统 施万细胞是外周神经系统中含量最多的胶质细胞，Lee-Kubli等[38]研究发现，脊髓损伤导致的大鼠神经病理性疼痛中，神经胶质细胞主要是通过影响DRG的神经元和施万细胞而调节疼痛。施万细胞在神经损伤后产生多种促炎细胞因子(包括TNF、IL-6和IL-1)，有助于外周感觉神经元的敏化和免疫细胞的募集，募集的巨噬细胞、T细胞和肥大细胞会增加促炎细胞因子的水平，以增强伤害性轴突的敏感性[20，39]。当神经受损时，施万细胞获得增殖能力并释放神经营养因子，如脑源性神经营养因子、神经生长因子、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell derived neurotrophic factor，GDNF)，它们可促进受损轴突的生长，但也会使感觉神经元敏感，从而促进神经性疼痛的发展。研究发现，外周神经损伤后，PKCα在施万细胞中表达明显上调，PKC激活剂佛波酯激活PKCα，PKCα通过激活胞外信号调节激酶信号通路促进施万细胞增殖和迁移[40]。近来有研究认为，褪黑素使GDNF和PKC蛋白表达显著提高，褪黑素激活GDNF/PKC通路，可促进施万细胞增殖，同时促进外周神经损伤的恢复[41]。因此，PKC可以通过施万细胞发挥神经免疫作用而调节疼痛。

外周神经损伤后，初级传入伤害感受器神经元将CXC趋化因子配体1等促炎介质释放到脊髓，诱导背角小胶质细胞产生TNF-α，TNF-α激活星形胶质细胞产生大量促炎介质导致脊髓神经元发生相应变化，促进中枢敏化。研究表明，有害刺激使伤害感受器从其外周末端释放神经肽和神经递质，如降钙素基因相关肽、P物质。树突状细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞和T细胞表达这些神经元介质的受体，使它们能够直接响应伤害感受器[22]。神经元通过CX3CL1受体活化相互作用与神经胶质细胞交流，PKC激动剂佛波酯能够以剂量依赖和时间依赖的方式诱导免疫物质(如CX3CL1)分泌，PKC抑制剂Ro-0432能够减少CX3CL1分泌，进而在调节淋巴细胞的运输以及调节细胞黏附、T淋巴细胞活化、吞噬作用、细胞因子分泌等方面发挥重要作用。PKC抑制剂(H-7)可以部分减弱免疫相关的降钙素基因相关肽的作用，加速细胞迁移和增殖，抑制细胞凋亡[38]。当神经损伤时，神经细胞还会释放大量P物质，使胞质内无活性的PKC转至细胞膜发生活化，活化的PKC又可诱导一氧化氮合酶发生磷酸化，使疼痛信号维持时间延长，导致中枢敏化[42]。可见，疼痛的发生发展机制还可能与PKC调节外周神经系统施万细胞及免疫细胞在疼痛状态下的功能有关，并与炎症因子、神经递质等的释放有关。

2.3中枢神经系统 在慢性疼痛期间，小胶质细胞在早期活化，并成为中枢神经系统的免疫细胞，其主要参与清除神经元和神经胶质细胞凋亡中的细胞碎片、帮助伤口愈合。活跃的小胶质细胞能够通过酶促作用从神经元膜上活化CX3CL1受体，从而增强免疫细胞的活性[43]，PKCα、PKCβ、PKCδ、PKCγ、PKCζ已被证明参与调节小胶质细胞的免疫反应活性[44]。研究发现，PKC通过p38促分裂原活化的蛋白激酶激活核因子κB，使M1型小胶质细胞产生促炎细胞因子而加重神经炎症[45]。此外，PKC参与调节腺苷A2A受体从抗炎转化到促炎状态，参与小胶质细胞增殖和炎症介质释放[44]。CC趋化因子受体5是细胞内趋化因子CC家族成员的受体，小胶质细胞CC趋化因子受体5表达水平与p-PKCγ有关，p-PKCγ通过CC趋化因子受体5介导小胶质细胞对免疫细胞的趋化作用[46]。Toll样受体4是一种先天免疫模式识别受体，主要在中枢神经系统的小胶质细胞表达，脊髓Toll样受体4的激活在由神经损伤、骨癌和组织炎症引起的病理性疼痛发生中起关键作用，IL-1β/PKC信号参与脊髓背角Toll样受体4对γ-氨基丁酸能突触活动的调节[47]。

星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多、体积最大的胶质细胞。星形胶质细胞表面分布着许多神经递质、神经营养因子受体、神经肽、激素及Na+、K+和Ca2+通道等。神经损伤后星形胶质细胞从静止状态转变为反应性，招募中性粒细胞和M1型巨噬细胞，参与胶质瘢痕形成。星形胶质细胞活化后炎症介质的产生和释放是神经炎症形成的关键因素，可介导中枢敏化和突触重塑以维持疼痛[48]。研究表明，促炎条件下星形胶质细胞表达不同的PKC亚型，包括PKCα、PKCβ、PKCδ[49]。慢性压迫背根神经节模型中，大鼠术侧脊髓背角内PKCε和胶质细胞原纤维酸性蛋白表达上调，PKC参与星型胶质细胞激活[50]。PKC具有磷酸化星形胶质细胞缝隙连接蛋白43并升高促炎细胞因子浓度的作用，其可促进星形胶质细胞促炎状态的形成[51]。PKC可介导神经递质谷氨酸和γ-氨基丁酸循环，影响中枢神经系统相邻突触的谷氨酰胺利用率和神经信号传递[49]，此外，PKCδ通过诱导表达型基因(c-Fos)/转录因子1炎症信号转导通路，上调基质金属蛋白酶-9并促进星形胶质细胞的迁移[52]。

以上结果表明，由疼痛信号激活的PKC通路可在慢性疼痛过程中调节小胶质细胞和星形胶质细胞炎症状态下的神经免疫反应活性。

3 小 结

自20多年前首次将神经炎症与慢性疼痛联系起来，神经系统和免疫系统之间的分界线已经变得越来越模糊，大量研究支持周围神经系统免疫细胞浸润和脊髓背角小胶质细胞激活在慢性神经性疼痛机制中的作用。神经免疫相互作用发生在外周损伤部位及中枢神经系统，PKC在外周神经和中枢神经系统占据着慢性疼痛调节的重要部位。PKC通过活化多种免疫细胞介导疼痛的发生发展，介导施万细胞和神经元活性发挥神经免疫调节作用，参与中枢小胶质细胞和星形胶质细胞的炎症反应，在神经元和非神经元之间疼痛的信息的传递中起着重要的作用。研究PKC调节慢性疼痛的神经免疫细胞机制有利于理解疼痛的神经-免疫-炎症机制，以期为慢性疼痛的治疗及预防研究提供新的视角和靶点。