传统泡菜制作与乳酸菌的分离观察

高悦皓

（厦门大学环境与生态学院，福建厦门 361000）

泡菜是一种独特的乳酸发酵蔬菜制品，食用后会摄入乳酸菌及乳酸等代谢产物，有助于调节肠道微生态平衡，达到预防疾病和保健的目的[1-2]。我国泡菜历史十分悠久，北魏贾思勰的《齐民要术》一书中，就有制作泡菜的叙述，可见至少1 400多年前，中国就有制作泡菜的历史。在清朝，川南、川北民间还将泡菜作为嫁奁之一，足见泡菜在人们生活中所占地位[3]。本实验通过制作传统泡菜，测定泡菜的理化指标，对制作泡菜不同阶段中的乳酸菌进行培养、计数与形态观察，了解发酵过程中乳酸菌的数量变化，同时通过自然发酵与人工加入乳酸菌两坛泡菜的对比，探究接种乳酸菌制作泡菜是否能提升制作速率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

凉白开、圆白菜、大蒜、花椒、干辣椒、生姜、冰糖、碘盐、蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乙酸钠、酵母提取物、柠檬酸二胺、磷酸氢二钾、硫酸镁、吐温80、溴甲酚紫、琼脂、泡菜乳酸菌粉、NaCl、pH计缓冲液、革兰氏染色液（结晶紫、碘液、95%乙醇、番红）、芽孢染色液（孔雀绿染液、7.6%饱和孔雀绿水溶液、番红水溶液）、3%过氧化氢溶液、放线菌酮。

1.2 仪器

SQP电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）］、培养皿、pH计、烧杯、厌氧培养袋、MGC-350BP-2光照培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、O2YMPVS CX21生物显微镜、接种环、C21-SDHCB06G电磁炉。

1.3 实验方法

1.3.1 传统泡菜的制作

购买新鲜的圆白菜，清洗，沥干，切分，用电子天平称取224.00 g装入泡菜缸，同时加入13.86 g大蒜、4.62 g花椒、4.62 g干辣椒、4.62 g生姜、36.96 g冰糖和36.96 g碘盐，最后向其中加入700 mL凉白开，封坛并做好标记存于阴凉处；取另一个泡菜缸，重复第一个的操作，并在封坛前向其中加入1包泡菜乳酸菌粉，做好标记同样存放于阴凉处。

1.3.2 MRS培养基及生理盐水的配制

称取蛋白胨1 g、牛肉膏1 g、葡萄糖 5 g、乙酸钠0.5 g、酵母提取物0.5 g、柠檬酸二胺0.2 g、磷酸氢二钾0.02 g、硫酸镁0.02 g、吐温80 0.1 g、溴甲酚紫 0.04 g及琼脂 1.5～2.0 g，加蒸馏水至100 mL，用电磁炉煮至彻底融化后装瓶备用。

称取0.85 g氯化钠固体，溶解于100 mL蒸馏水中，再通过梯度稀释配制多种梯度的0.85%无菌生理盐水。

1.3.3 乳酸菌pH值测定方法

用移液枪从泡菜缸内取5 mL泡菜液于烧杯中，对pH计进行校正后，对其进行pH测定。

1.3.4 乳酸菌培养方法

从泡菜缸中取泡菜液，估算合适的梯度，进行稀释平板涂布，并将培养皿封入厌氧培养袋后放入37 ℃光照培养箱进行培养。

1.3.5 革兰氏染色、芽孢染色和接触酶测试方法

（1）革兰氏染色。涂片、干燥，并在酒精灯火焰上过火固定，然后滴加结晶紫染色1～2 min，后用水冲洗，接着滴加碘液染色1 min后，用水冲洗，甩尽残余水，再用95%乙醇冲洗30 s，严格控制时间和浓度，然后立即用水冲洗。接着用番红覆盖涂片进行复染，染3～5 min，水洗，晾干，最后先用低倍镜观察，后用高倍镜观察。

（2）接触酶测试。先在载玻片上加1滴3%H2O2，然后用非金属接种工具刮取斜面或平板上的培养物与其混合，再用肉眼或低倍镜观察其冒气情况。

（3）芽孢染色。将培养24 h左右的菌体，进行涂片、干燥、固定，再滴加3～5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上，用饱和的孔雀绿水溶液（约7.6%）染10 min，然后倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止，再用番红水溶液复染1 min，水洗，最后待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。

1.3.6 乳酸菌形态、数量观察

对培养的平板上的乳酸菌进行肉眼计数和放大镜观察。

2 结果与分析

2.1 泡菜制作过程的观察

经实验观察发现，泡菜第1 d是绿色，随着时间的延长，其颜色逐渐变为黄色，泡菜液从澄清逐渐变浑浊，这是泡菜发酵过程中色素溶解、细菌代谢、乳酸菌演替所产生的正常现象[4]。

2.2 泡菜液pH值

由图1可知，未加乳酸菌的泡菜液的pH值随着发酵天数的增加呈现出先升高后下降的趋势，在第3 d左右开始逐渐趋于平缓[5]，最终pH值在3.22左右。pH值最开始升高是因为发酵刚开始时蔬菜表面还存在一些革兰氏阴性好氧菌和一些氧化酵母菌，它们利用最初一段时间的有氧环境和乳酸菌产生的乳酸进行代谢，造成乳酸消耗，最终让pH值有短暂的上升过程。

图1 两缸泡菜液的pH值随时间的变化曲线图

通过加入乳酸菌的泡菜液的pH值变化曲线可以看出，pH值从一开始便呈现出下降的趋势，并且在第2 d左右就开始逐渐趋于平缓，最终pH值在3.10左右。这与未加乳酸菌不同的原因是加入大量乳酸菌后，从一开始乳酸菌就在泡菜中占据绝对优势，产生大量乳酸，酵母菌等其他杂菌开始便难以生长，所以pH值从一开始便呈现出下降的趋势。

通过两者对比，可以看出加入乳酸菌的泡菜pH值趋于平缓的时间要早于未加乳酸菌的泡菜，说明加入乳酸菌可以加快泡菜的制作。最终到达的pH值也是加入乳酸菌的泡菜要略低于未加乳酸菌的泡菜，推测原因是乳酸菌数量多所产乳酸也较多，虽然经过一段时间的种群数量变化和乳酸动态变化会逐渐趋于一致，但是加入乳酸菌的泡菜最后酸性仍会略强一些。

2.3 乳酸菌优势度检验

由图2革兰氏染色结果可以看出，未加乳酸菌粉泡菜液培养基中的菌株和加入乳酸菌粉泡菜液培养基中的菌株几乎均被染为紫色，只有少量为红色，说明绝大部分菌株都是以乳酸菌为代表的革兰氏阳性菌。未加乳酸菌粉泡菜液培养基中的菌株少数呈现红色的原因可能是有少量酵母菌和大肠杆菌等革兰氏阴性菌在培养第2 d还没完全死亡或染色时番红染液浸染时间过长[6]。

图2 培养基菌株革兰氏染色结果图（10×100）

由图3芽孢染色结果可知，未加乳酸菌粉泡菜液培养基中的菌株和加入乳酸菌粉泡菜液培养基中的菌株几乎均被染为红色，极少数为绿色，说明绝大部分都是菌体。极少数呈现绿色的原因可能是有少量枯草芽孢杆菌等芽孢杆菌在培养第2 d天还没完全死亡或染色时孔雀石绿染液浸染时间过长。

图3 培养基菌株芽孢染色结果图（10×40）

由图4接触酶测试可知，菌株与H2O2接触时肉眼几乎看不到任何变化，说明泡菜缸中的细菌几乎不含产气菌。

图4 培养基菌株接触酶测试结果图

综合以上3个检测试验，可以排除绝大部分革兰氏阴性菌、芽孢杆菌和产气菌，说明泡菜缸内的菌体几乎全部为革兰氏阳性菌、厌氧细菌——乳酸菌。

2.4 乳酸菌数量的观察

从图5可以看出，未加乳酸菌的泡菜缸内乳酸菌数量呈现先升高后降低的趋势，在第4 d数量达到最多，且在第7 d后仍会降低，但推测会逐渐趋于平缓。推测原因是最开始乳酸菌数量还未达到饱和，盐分使白菜中的可溶性物质进入泡菜液为乳酸菌提供营养，且逐渐形成的无氧环境会让乳酸菌在与其他杂菌的竞争中占据优势，从而加速增长，在第4 d数量由于资源的限制到达饱和值，且过多的乳酸抑制了乳酸菌的生长，其数量开始逐渐下降，但由于实验天数有限，因此统计到第7 d后仍呈下降趋势，但推测会逐渐趋于平缓，达到动态平衡[7-9]。加入乳酸菌的泡菜缸内乳酸菌数量呈现先下降后趋于平缓的趋势，从第5 d开始乳酸菌数量基本保持不变。这可能是因为刚开始时乳酸菌是绝对的优势种群，其数量超过了饱和值，因此会一直下降以达到动态平衡[10]。

图5 两缸泡菜液的乳酸菌数量随时间的变化曲线图

通过两者对比，可以看出加入乳酸菌的泡菜缸内乳酸菌数量相较于未加乳酸菌会更快到达稳定值，且最后的稳定值要更高。

2.5 乳酸菌形态的观察

如图6所示，乳酸菌菌落大致有以下几种形态特征：①边缘整齐，表面光滑，中央有凸起或扁平的白色或乳白色菌落，菌落直径在0.5～1.0 mm；②边缘不整齐、表面粗糙无光泽、中央有凸起或中央扁平的褐色或乳黄色半透明菌落，直径约为0.5～3.0 mm；③圆形、边缘整齐、表面光滑、扁平隆起的灰白色菌落，菌落直径在1.0～2.0 mm；④圆形、边缘整齐、不透明、中心凸起的乳白色菌落，菌落直径在1.0 mm左右；⑤圆形边缘光滑半透明微凸起的白色菌落，菌落直径在1.0 mm左右。

图6 MRS培养基乳酸菌观察图

3 结论

通过本实验的研究结果发现，自然发酵的传统泡菜的pH值会呈现先升高后降低并在第3 d开始逐渐趋于平缓的趋势，且最高值出现在第1～2 d，乳酸菌数量会呈现先升高后降低的趋势，推测也会逐渐趋于平缓，最高值出现在第4 d左右，这是由于乳酸菌在逐渐无氧的内部环境里逐渐在与其他杂菌的竞争中占据优势的原因。加入乳酸菌发酵的泡菜的pH值从一开始便会逐渐下降，在第2 d左右就会逐渐趋于平缓，乳酸菌数量一开始就下降并在第5 d开始逐渐趋于平缓，这是由于乳酸菌数量一开始就处于绝对优势，超过了资源的可容纳范围，逐渐下降并最终达到与资源相适应的动态平衡。通过两种泡菜对比分析，可以看出加入乳酸菌可以明显加快泡菜的制作速度，且最后的pH和乳酸菌数量都会略多于自然发酵的泡菜。