铁对过表达α-syn诱发iPC12细胞内钙离子增多影响

张静娴　陈蕾蕾　谢俊霞

[摘要] 目的 研究铁过载试剂对过表达α-突触核蛋白（α-syn）诱发iPC12细胞内钙离子增多的影响。方法 用多西环素（DOX）处理iPC12细胞48 h，诱导其高表达α-syn。实验分为对照组、DOX组、DOX+枸橼酸铁胺（FAC）组和DOX+去铁胺（DFO）组。对照组用细胞培养液处理48 h;DOX组用DOX处理48 h;DOX+FAC组给予DOX预处理24 h后，用FAC处理24 h;DOX+DFO组给予DOX预处理24 h后，用DFO处理24 h。通过检测细胞内钙离子浓度评估细胞钙稳态。结果 与DOX组相比，DOX+FAC组细胞内钙离子浓度升高（F=43.84，q=4.074，P<0.05），DOX+DFO组细胞内钙离子浓度无明显变化（q=1.430，P>0.05）。结论 铁过载可加剧α-syn过表达诱发的细胞内钙离子水平升高。

[关键词]铁;α突触核蛋白;PC12细胞;钙

[中图分类号]R338.2[文献标志码]A[文章编号]2096-5532（2022）03-0361-03

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.102

EFFECT OF IRON ON INTRACELLULAR CALCIUM INCREASE IN IPC12 CELLS INDUCED BY OVEREXPRESSION OF α-SYNUCLEIN

ZHANG Jingxian， CHEN Leilei， XIE Junxia

（Institute of Brain Science and Diseases， Qingdao University， Shandong Provincial Key Laboratory of Pathogenesis and Prevention of Neurological Disorders， Shandong Provincial Collaborative Innovation Center for Neurodegenerative Disorders， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of the iron-overload reagent on intracellular calcium increase in iPC12 cells induced by the overexpression of α-synuclein （α-syn）. Methods iPC12 cells were treated with doxycycline （DOX） for 48 h to induce the high expression of α-syn. In the experiment， cells were divided into control group， DOX group， DOX+ferric ammonium citrate （FAC） group， and DOX+desferrioxamine （DFO） group. The control group was treated with cell culture fluid for 48 h. The DOX group was treated with DOX for 48 h. The DOX+FAC group was treated with FAC for 24 h after DOX pretreatment for 24 h. The DOX+DFO group was treated with DFO for 24 h after DOX pretreatment for 24 h. Cellular calcium homeostasis was assessed by detecting the intracellular calcium concentration. Results Compared with the DOX group， the intracellular calcium concentration in the DOX+FAC group was significantly increased （F=43.84，q=4.074，P<0.05）， and no significant change was found in the intracellular calcium concentration in the DOX+DFO group （q=1.430，P>0.05）. Conclusion Iron overload can aggravate the increase in intracellular calcium concentration induced by the overexpression of α-syn.

[KEY WORDS] iron; alpha-synuclein; PC12 cells; calcium

作為全球第二位的神经退行性疾病，帕金森病（PD）病理特点是黑质区多巴胺能神经元丢失，且残存的细胞内存在以α-突触核蛋白（α-syn）聚集体为主的路易小体并伴有铁沉积[1-3]。研究表明，宽尖峰动作电位、自主起搏电活动、胞浆钙振荡和较低的钙缓冲能力是黑质区多巴胺能神经元区别于其他神经元的重要生理特征，而这种差异可能是PD黑质区多巴胺能神经元选择性丢失的重要原因[4-5]。PD中钙稳态失调可以通过增加超氧化物和活性氧的产生使氧化应激水平升高，而氧化应激增加是PD中多巴胺能神经元死亡的机制之一[6-8]。引起PD中钙稳态失衡可能与α-syn聚集和铁沉积有关，但具体机制尚未完全阐明[9-11]。有研究显示，聚集形式的α-syn和枸橼酸铁铵（FAC）均可以使原代神经元细胞质中钙离子增加[9-12]。最近研究表明，经错误折叠后寡聚体形式的α-syn可使细胞膜完整性破坏，细胞内钙离子增多并诱发铁死亡[11]。然而，铁过载能否加剧α-syn诱发细胞内钙离子增多这一过程，目前尚不清楚。本研究拟应用多西环素（DOX）诱导iPC12细胞高表达α-syn，并在该细胞模型上探讨FAC对过表达α-syn诱发iPC12细胞内钙离子增多的影响。现将结果报告如下。

1材料和方法

1.1实验材料

本实验所用的iPC12细胞系为稳转外源（人）SNCA（A53T）PC12细胞系，PC12细胞系是大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤分化细胞株;DMEM高糖培养液和胰蛋白酶购于Hyclone公司;胎牛血清购于依科赛公司;马血清和GENETIXIN购于Gibco公司;FAC、去铁铵（DFO）、钙比色测定试剂盒和DOX均购于Sigma公司;潮霉素B购于赛默飞公司;磷酸酶抑制剂（04906837001）购于罗氏公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2细胞培养

细胞培养实验非无菌器具均高压灭菌烘干后使用。待所用培养液在37 ℃水浴锅中预热后，将液氮冻存的细胞取出，迅速放置在37 ℃水浴锅中，快速摇晃至完全融开，将全部细胞悬液转移至10 mL已预热的完全培养液中，吹打均匀后以1 000 r/min离心5 min。离心后弃上清液，用5 mL完全培养液重悬细胞，然后转移至25 cm3的培养瓶中，将培养瓶放在细胞培养箱中静置培养（37 ℃、含体积分数0.05 CO₂）。每4～5 d传代1次，传代3次后以1×10⁸/L接种于六孔板中，每孔加2 mL完全培养液。细胞汇合度达70%～80%时进行后续处理。

1.3实验分组及处理

为观察铁过载对iPC12细胞内钙离子的影响，将细胞随机分为对照组、DOX组、DOX+FAC组和DOX+DFO组。对照组用细胞培养液处理48 h，DOX组用2 mg/L的DOX处理48 h，DOX+FAC组细胞先给予2 mg/L的DOX处理24 h后再用100 μmol/L的FAC处理24 h，DOX+DFO组给予2 mg/L的DOX处理24 h后再用100 μmol/L的DFO处理24 h。

1.4细胞内钙离子测定

六孔板药物处理完毕，负压吸取上清后，使用0.01 mol/L的PBS润洗1次，吸净液体，每孔加入100 μL细胞裂解液，置冰上裂解半小时后，用刮板尽可能将细胞刮下，并转移至1.5 mL的EP管中，4 ℃下以12 000 r/min离心30 min后，吸取85 μL上清。钙比色测定试剂盒平衡至室温后，将标准品用双蒸水稀释至每孔0、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 μg。每孔加入待测样本40 μL，然后用双蒸水补足至体积50 μL。在标准品孔和待测样本孔中分别加入90 μL显色试剂，然后每孔加入60 μL钙缓冲试剂，轻轻混匀后在37 ℃环境中避光孵育15 min。用酶标仪（SpectraMax M5，Molecular Devices）在波长575 nm处测量标准品和待测样本的吸光度值。

1.5统计学分析

应用Graph Pad Prism软件进行统计学处理。计量资料结果以x±s表示，多组之间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1铁过载对过表达α-syn诱发细胞内钙离子增多的影响

对照组、DOX组和DOX+FAC组的细胞内钙离子浓度分别为（0.192±0.007）、（0.237±0.005）和（0.292±0.017）mmol/L（n=3），3组比较差异有统计学意义（F=43.84，P<0.05）。与对照组相比较，DOX组细胞内钙离子浓度明显升高，差异有统计学意义（q=3.187，P<0.05）;与DOX组相比，DOX+FAC组细胞内钙离子浓度进一步升高，差异有统计学意义（q=4.074，P<0.05）。提示FAC可加剧过表达α-syn诱发的细胞内钙离子水平升高。

2.2DFO对过表达α-syn诱发细胞内钙离子增多的影响

對照组、DOX组和DOX+DFO组的细胞内钙离子浓度分别为（0.192±0.007）、（0.237±0.005）和（0.216±0.020）mmol/L（n=3），3组比较差异有统计学意义（F=5.97，P<0.05）。与DOX组相比较，DOX+DFO组细胞内钙离子浓度无明显变化（q=1.430，P>0.05）。提示DFO对过表达α-syn诱发的细胞内钙离子水平升高无明显影响。

3讨论

钙是细胞内调控重要生命活动的第二信使，细胞质内的低钙浓度（100 nmol/L）是细胞信号中灵敏激活钙级联反应的关键[13]。已有研究结果表明，PD中钙稳态失调可以通过增加α-syn聚集和线粒体氧化应激对细胞产生损伤[6，14]。一方面，钙除了调控α-syn分泌外，还可以与其C端结合，引起非淀粉样成分结构域变化，促进β-折叠结构形成，从而促进α-syn聚集体的形成[14-15];另一方面，钙信号可以通过增加超氧化物和活性氧的水平来破坏线粒体复合体Ⅰ和Ⅲ[16]。

钙促进α-syn聚集后，聚集的α-syn可以作用于细胞膜，导致钙离子内流，也可以引起细胞氧化损伤[11]。铁沉积作为PD的显著病理特征，不仅可以促进α-syn聚集，还可以增加氧化应激水平[17-18]。铁过载在神经元细胞上可以通过激活内质网上的Ryanodine受体，增加细胞内钙离子的水平[12]。虽然α-syn聚集和铁沉积分别会引起细胞内钙离子水平升高，但却鲜有研究报道二者共同作用对细胞内钙离子的影响。本研究结果表明，铁过载可以加剧α-syn诱导的细胞内钙离子浓度增高，但是铁和α-syn共同作用引起钙离子变化的机制仍需要进一步研究。本研究结果还表明，DFO对过表达α-syn诱导的细胞内钙离子增多无明显影响。推测这可能是由于DFO不能进入细胞，无法有效阻断铁激活内质网上Ryanodine受体引起细胞内钙离子增多的过程。黑质致密带多巴胺能神经元自主起搏电活动主要依赖于L型钙通道的Cav1.3亚型[19]。而且有文献报道，早期PD病人大脑中Cav1.3/Cav1.2的表达比值增加[20]。由上述研究可知，L型电压门控通道在PD的钙稳态失衡中至关重要。因此，接下来的研究可进一步探索铁和α-syn引起细胞内钙离子增多时L型电压门控通道的变化，这为后续研究PD中钙稳态失衡机制提供了新的思路。但PD中钙稳态失衡的具体机制以及PD中异常钙离子如何流动还有待进一步研究探讨。

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（本文編辑马伟平）