相互作用下多酚对肌原纤维蛋白结构和性质的影响研究进展

黄 剑，李书艺，祝振洲，熊光权，吴文锦，石 柳，何静仁，丁安子，乔 宇，汪 兰,*

（1.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，湖北 武汉 430064；2.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023）

肌肉中的蛋白质按照各自溶解性的不同可主要分为3 类：水溶性的肌浆蛋白、不溶性的基质蛋白以及盐溶性的肌原纤维蛋白（myofibrillar protein，MP）[1]，其中MP含量最高，占肌肉蛋白含量的50%～55%左右[2]，它对于蛋白质品质的影响非常显著，也直接决定了肉品的风味特性、营养价值和加工性能[3-4]。但MP在加工贮藏过程中又极易发生氧化变质，对蛋白性质和肉品品质产生不利影响。一直以来，对于蛋白质氧化的研究大多关注于蛋白质氧化过程与人体衰老、疾病等方面的联系[5-6]，而对于食品体系中蛋白质氧化所产生的影响研究较少。这一方面是因为蛋白质氧化的机理相当复杂，对它的研究需要一个相对漫长的过程；另一方面是因为过去研究手段的不足和落后，以及消费者对于食品安全问题的不重视。然而近年来科技迅猛发展，人们生活水平不断提高，消费者也对于食品安全问题越发关注，这使得对于食品体系中蛋白质氧化的研究成为热点。一般来说，氧化对于MP的影响有氨基酸侧链修饰、肽链骨架断裂、蛋白质交联聚集、空间构象改变、内部基团暴露以及功能性质改变等[7-8]。而同时MP的氧化也会对肉制品加工性能产生一系列不利影响[9-11]，如肌肉嫩度降低[12]、肉色稳定性变差[13]、持水力下降[14]以及消化性降低[15]等。并且有研究发现，蛋白质氧化对其功能性质的改变受氧化程度的影响，氧化程度较低时，蛋白质氧化会增强自身功能性质（如凝胶特性），而氧化程度较高时则会对蛋白结构和功能性质产生不利影响，破坏肉品的口感和营养价值，甚至可能产生有害物质，进而影响肉品品质，威胁消费者的身体健康[16-17]。

在食品工业中，为了延缓蛋白质氧化进程，常见做法是加入抗氧化剂。但合成的抗氧化剂具有毒性以及各种弊端，再加上近年来消费者对于食品安全和营养健康等方面越发重视[18]，对于天然抗氧化剂的研究成为热点，尤其是多酚。多酚不仅是天然的植物提取物，还具有良好的抗氧化能力，并且在食品中添加的香辛料等物质中也常含有多酚[17]，因此，它成为理想的合成抗氧化剂代替物。多酚与MP的相互作用不仅会改变MP的氧化进程，也会对多酚的抗氧化活性、蛋白质结构和营养特性等方面产生影响。本文综述了MP氧化机制、多酚与MP相互作用机制和多酚的构效关系；探讨了多酚与MP相互作用对蛋白质结构、功能和营养特性的影响，旨在为食品工业中多酚在肉品保藏中的应用提供理论指导。

1 食品中肌原纤维蛋白的氧化及其机制

由于动物被屠宰后体内抗氧化系统逐渐崩溃，肌肉中又充满着各种金属离子、血红素等氧化诱发剂，体内的酶也开始溶解细胞组织，这使得死后动物体内的MP氧化反应极易发生并且反应快速。需要说明的是，在活体动物体内也会发生蛋白质氧化，但生物体内自有一套完整的抗氧化系统来阻止氧化反应的发生。

根据Soladoye等[8]的研究，MP氧化是一个在活性氧（reactive oxygen species，ROS）诱导下的蛋白质共价修饰反应。ROS是在细胞中广泛分布的、具有生理活性的一类代谢产物，它主要来源于线粒体，由分子氧产生[19-20]，是一类含氧的具有生物活性的大分子的统称。ROS主要包括羟自由基（•OH）、超氧阴离子自由基、过氧化氢自由基（ROO•）、一氧化氮自由基（NO•）以及烷氧自由基、烷过氧自由基等[11,21]。其中超氧阴离子分布最为广泛[22]，羟自由基（•OH）氧化活性最强，危害最大[23]。一般认为，羟自由基（•OH）可由歧化反应和经典的芬顿反应（表1）产生[24-25]。

表1 芬顿反应历程Table 1 Course of the Fenton reaction

研究表明，与肉制品中脂质氧化反应类似，MP的氧化也是一个自由基链式反应过程[26]（表2）。首先，ROS夺取MP分子（PH）上的一个氢原子，使其成为碳中心自由基（P•）（第一阶段）。在有氧环境下，P•会进一步反应生成POO•（第二阶段）。POO•可从别的PH上夺取一个氢原子，或是与Fe2＋发生氧化还原反应，亦或是被质子化的超过氧化自由基攻击，最终都会生成烷基过氧化物POOH（第三阶段）。POOH可继续和过氧化自由基HO2•、Fe2＋等反应生成烷氧自由基PO•（第四阶段），此烷氧自由基PO•还可与HO2•、Fe2＋等发生反应并最终生成羟基衍生物POH（第五阶段）[16,27]。

表2 MP氧化过程Table 2 Course of myofibrillar protein oxidation

2 多酚抗肌原纤维蛋白氧化作用及构效关系

在工业生产中，通常加抗氧化剂来抑制MP的氧化，多酚是一种植物次生代谢产物，是公认的天然抗氧化剂，抗氧化效果显著[28]。多酚来源广泛，几乎存在于所有植物中，并且蔬菜、水果、茶叶以及谷物中的多酚含量最高[29-30]。

2.1 多酚的分类

多酚是多羟基酚类化合物的总称，其共同特征是具有典型的酚环结构，即至少含有一个芳香环以及一个或多个羟基取代基[31-32]。目前已知的植物多酚就有8 000多种，关于多酚的分类也众说纷纭，Singla等[30]将多酚简单地分为黄酮类和非黄酮类，再根据其分子结构内的苯酚单元的数量、取代基团和/或苯酚单元之间的连接类型进行细分；钱敏[33]将植物多酚分为5 类，包括酚酸、黄酮类、单宁、芪类及木脂素；此外，Camelia等[34]将多酚分为3大类若干小类（表3），这种分类方式最为详细具体，能让人充分了解多酚的结构特点。

2.2 多酚的抗肌原纤维蛋白氧化作用

尽管多酚种类繁多，但对于MP氧化反应均表现出抗氧化活性，这些抗氧化效果由于多酚结构、浓度、pH值、温度等环境条件的差异而不尽相同。张慧芸等[35]采用羟自由基氧化体系研究不同多酚对于猪MP氧化的影响，结果表明，添加0.05%鞣酸和0.25%没食子酸可显著抑制MP中羰基与二聚酪氨酸含量的增加，抗氧化效果显著。Rysman等[36]发现苹果中的酚类化合物（绿原酸、表儿茶素、根内苷以及苹果皮提取物）能够在10 d内抑制MP中的蛋白质氧化。但Tine等[37]以乳化型香肠蛋白为研究对象，却发现苹果多酚与蛋白的共价作用能增加其羰基含量，同时导致巯基损失量显著增加。贾娜等[38]研究发现添加儿茶素能减少MP羰基化合物的产生，但添加过量会促进MP氧化。Li Xuepeng等[39]研究发现低浓度的茶多酚对于MP具有很好的抗氧化效果，而高浓度时却会促进氧化，这与Estévez等[40]的研究结果类似，即多酚对于MP的抗氧化作用与多酚浓度有关。袁圣亮等[41]研究了海藻多酚后，认为海藻多酚抗氧化活性与多酚浓度、提取工艺以及多酚结构都有关。Xu Mingfeng等[42]则认为酚类化合物的浓度、结构以及氧化条件都会影响其抗氧化效果。

2.3 多酚的结构对其抗氧化活性的影响

多酚类物质的抗氧化作用主要包括3种机制[43]：螯合过渡金属离子[44-45]、淬灭单线态氧[46-47]和清除自由基[48]，除此之外还有抑制氧化酶等作用[49]。然而，有研究表明，不同的多酚会因为各自结构上的差异而导致它们在抗氧化活性上各有特点[50]。Xiao Jianbo等[32]认为黄酮类化合物是广泛存在于植物中的主要多酚类物质，其分子结构的多样性是由中心吡喃环的羟基化模式和氧化状态的变化引起的。2004年，Li Binghui等[51]研究了15种黄酮类化合物对动物脂肪酸合成酶的抑制作用，发现B环含2 个羟基、A环含5,7-羟基并结合C-2,3双键的黄酮类化合物抑制效果最好。2005年，Li Binghui等[52]又发现在此抑制作用中，A环和B环起着重要作用，而C环不是必需的。Ahmadi等[53]研究了木犀草素与儿茶素的构效关系，发现儿茶素中的3-OH基团对于1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除作用优于木犀草素中的1,4-吡喃酮部分。同样，铁离子还原法实验表明，儿茶素在将单电子转移到接受电子的自由基方面比木犀草素有更高的效力。Vu等[54]发现普洱茶多酚中茶黄素结构多样性主要由其9 个－OH基团的变化引起，不同的3D构象被茶多酚系统内相互作用的复杂网络所稳定，并且这种强化性和稳定性与自由基清除能力相结合。Kumaran等[55]研究表明多酚的抗氧化活性同自由基反应后形成的半醌自由基的稳定性及苯环上羟基的数量有关。Estévez等[40]研究了不同酚类物质（没食子酸、花色苷、表儿茶素、绿原酸等）的构效关系，发现花青素的化学结构（黄酮阳离子）是其具有抗氧化能力的主要原因，因为B环中的3’,4’-二羟基（儿茶酚结构）提供了还原能力，而A和C环中的羟基和阳离子则使生成的自由基具有稳定性，并且C环上的3-糖基化增强了其自由基清除活性。染料木素B环上没有儿茶酚结构也同样具有相当的抗氧化活性，可能是因为异黄酮类物质由B环上的3’-羟基充当氢供体，而羰基与5’-羟基相互作用，形成稳定结构。此外，A环的5’-羟基与C环的4’-酮是异黄酮类化合物与金属离子结合的关键结构。而没食子酸的抗氧化活性则来源于其芳香环的3 个羟基（邻苯三酚结构），并且其抗氧化活性明显高于绿原酸。

表3 多酚的主要类别Table 3 Major categories of plant polyphenols

3 多酚-肌原纤维蛋白相互作用对蛋白结构和性质的影响

多酚的多羟基酚环结构决定了其具有独特的抗氧化能力，这在肉制品加工保藏的应用中表现得尤为明显。多酚对于肉品品质的提升主要体现在肉的嫩度、持水力以及肉色稳定性等方面[67]。嫩度主要由肌肉中结缔组织、肌原纤维和肌浆蛋白含量与化学结构状态决定，多酚可通过提高肌浆蛋白含量，改变肌纤维密度、直径和横截面积来提高肉的嫩度[68-69]。肌肉持水力是肌肉组织在加工贮藏过程中维持水分的能力，是评定肉质的重要指标，有研究表明添加多酚可显著提高肌肉对水分的束缚能力[69-70]。肌肉中肌红蛋白含量和存在状态决定了肌肉肉色，而多酚可以一定程度上抑制肌红蛋白氧化成高铁蛋白，维持其肉色稳定性[71-72]。另外，多酚还能够通过降低肌肉中丙二醛的含量来抑制脂肪氧化[73]，这也有利于提升肉品品质。

3.1 多酚-肌原纤维蛋白相互作用机制

多酚与MP之间的相互作用方式可分为两种类型，即非共价相互作用与共价相互作用。这两种作用在食品体系中可同时存在，并且前者占主要地位，一般可逆；而后者在食品体系中存在较少且不可逆[74]。

3.1.1 非共价相互作用

多酚与MP的非共价相互作用，主要包括疏水相互作用、范德华力、氢键、静电相互作用等（图1）。这些作用力通常较弱，因为它们不涉及共享电子对，并且总是可逆的[75-76]。其中，疏水相互作用和氢键是两者非共价结合的主要作用力[77]。Jia Na等[78]研究了不同的儿茶素浓度对猪肉MP构象和凝胶特性的影响，发现儿茶素能使MP构象发生改变，低浓度时MP表面疏水性降低，高浓度时表面疏水性增加且巯基含量下降，推测这可能是由于儿茶素与MP非共价结合导致其疏水结构域暴露。吕卫金等[79]研究了茶多酚对冷藏大黄鱼MP变性降解的影响，发现两者的结合有疏水相互作用的参与，并且MP表面疏水性与结合时间呈显著线性相关。有研究表明，非极性基团之间的疏水相互作用相对较强，它是由酚类物质的芳香环和蛋白质的疏水位点相互作用引起的[80-81]。Xie Wanlin等[82]的研究表明绿原酸与MP的结合依赖于范德华力和氢键，而槲皮素与MP的结合依赖于静电相互作用。

图1 多酚与肌原纤维蛋白非共价相互作用[17]Fig. 1 Non-covalent interaction between polyphenols and myofibrillar protein[17]

3.1.2 共价相互作用

一般来说，酚类化合物具有很高的生物活性，当氧、酚类化合物和多酚氧化酶同时存在时，酚类物质可被氧化成相应的半醌类和醌类，这些半醌和醌类能够作为反应底物进一步与亲核试剂发生共价反应，并且反应的先决条件是产生亲电物质，由蛋白质提供亲和侧链进行亲核加成[83]。很明显的是，就酚类化合物的结构而言（小分子如酚酸，复杂分子如原花青素），结构越复杂，相应的反应产物也会越复杂。多酚与MP的共价作用就是通过前者氧化或亲核加成形成醌或半醌自由基结构，从而与后者形成共价结构[84]，具体来说，多酚与MP的结合主要有两条路径，其一是和MP的巯基反应形成“巯基-醌”加成产物，另一条路径是和MP的氨基反应形成“氨基-醌”加成产物（图2）。Rohn[85]、Rawel[86]和Kroll[87]等研究表明，在碱性条件和室温下，不含多酚氧化酶时，可将蛋白质/酶与酚类和相关化合物进行衍生化，并且此衍生化反应是多酚与蛋白质共价结合的结果。Jongberg等[88-89]研究表明，酚类物质氧化形成醌与MP的巯基反应，使MP巯基和游离氨基水平显著降低，并形成共价的巯基-醌加合物，此加合物的形成还受到不同加工条件的影响。Pan Jinfeng等[90]研究了不同剂量没食子酸对氧化应激日本虹鱼MP凝胶特性的影响，发现相比于单纯的氧化MP，添加了高剂量没食子酸的MP出现了一个较窄但强度较高的峰，说明高剂量的没食子酸可与MP形成巯基-醌加合物，促进聚合。Chen Jinyu等[91]研究发现，(－)-表没食子儿茶素和三聚磷酸钠的添加均抑制了MP羰基的形成，但也促进了硫醇和游离胺基团的丢失，并且三聚磷酸钠的存在增强了(－)-表没食子儿茶素与MP的硫醇和游离胺之间的共价反应。Nie Xiaohua等[92]以葡萄籽原花青素和绿茶多酚为原料制备了MP膜，发现在结合膜中MP溶解度下降，蛋白质图谱中主要蛋白条带强度明显下降，这表明苯酚与MP之间形成共价交联。Nie Xiaohua等[93]还研究过以单宁酸和苹果原花青素为原料制备MP膜，发现单宁与MP之间可通过非二硫共价键交联，形成蛋白质-酚类-蛋白质聚合物。

图2 多酚与肌原纤维蛋白共价相互作用[17]Fig. 2 Covalent interaction between polyphenols and myofibrillar protein[17]

3.2 多酚-肌原纤维蛋白相互作用对蛋白质结构特征的影响

早有研究表明，多酚与MP的相互作用会对MP的二、三级结构产生显著影响，这些影响因多酚的浓度、化学结构等的不同而有差异[94]。MP的二级结构主要指的是α-螺旋和β-折叠，许多研究表明，加入多酚后，MP分子结构展开，会导致β-折叠含量的增加与α-螺旋含量的减少[95]。MP的三级结构主要通过其色氨酸荧光强度来表征，这是因为当MP处于折叠状态时，色氨酸残基通常位于核心的疏水环境，此时表现出较高的荧光强度，而多酚与MP结合之后，MP结构展开，色氨酸残基暴露于亲水环境中，导致荧光强度降低[96]。

Cheng Jingrong等[97]利用桑树多酚来修饰MP并观察MP构象的变化，结果发现槲皮素对MP二级结构影响不大，而咖啡酸使MP的α-螺旋结构转变为β-螺旋结构，并且得到的蛋白在所有样品中具有最强的荧光猝灭、溶解性和抗氧化活性。Zhang Yumeng等[98]的研究表明甲基-β-环糊精的加入可阻止表没食子儿茶素没食子酸酯引起的MP二级结构改变。李玲等[99]在研究氧化条件下茶多酚对猪肉MP理化和凝胶特性的影响时发现，茶多酚能够很好地稳定MP的结构，推测可能是因为茶多酚与MP发生疏水相互作用，从而阻碍了溴酚蓝与MP表面疏水基团的结合，导致疏水性降低。Li Xuepeng等[39]研究了不同浓度的茶多酚对于草鱼MP理化性质和结构等方面的影响，结果表明，低浓度茶多酚能有效抑制羰基和二酪氨酸的形成、巯基和α-螺旋构象的消失以及羟自由基引起的MP三级结构的改变，各浓度茶多酚的存在降低了MP的表面疏水性。Pan Jinfeng等[90]研究了没食子酸对氧化应激日本虹鱼MP性质的影响，结果表明，没食子酸抑制了羰基的生成，保护了游离胺，低浓度的没食子酸稳定了巯基和二级结构，而高浓度时则会使巯基损失较大，α-螺旋结构含量减少。这说明多酚对于MP结构的影响还会受到前者浓度的影响。

3.3 多酚-肌原纤维蛋白相互作用对蛋白质性质的影响

3.3.1 多酚-肌原纤维蛋白相互作用对蛋白质功能特性的影响

多酚与MP之间的相互作用不仅会对MP结构造成影响，还会改变MP的功能特性（表4）。MP的功能特性主要包括蛋白溶解性、表面疏水性、凝胶性和乳化性[17]。MP的表面疏水性通常与其溶解度呈负相关，蛋白表面疏水性反映了疏水氨基酸残基在蛋白表面的分布情况，当表面疏水性上升时，表明蛋白结构展开，更多的疏水性氨基酸暴露于蛋白表面，导致其溶解度下降；因此，MP溶解度的变化也可从侧面反映表面疏水性的变化[16]。蛋白质的乳化能力指的是蛋白质溶液乳化脂肪的能力，反映其与脂肪的结合程度[100]。同时，有研究表明，较高的表面疏水性往往会导致界面张力的降低和乳化活性的增加[101]。另外，氧化的酚类化合物会阻止凝胶在油-水界面展开，从而有效地在油滴周围形成一层膜，提高了凝胶的乳化稳定性[102]。

然而，上述这些影响并不是绝对的，有些研究表明多酚的加入对于MP的影响表现出复杂性，这些影响不仅与多酚结构和浓度有关，还与pH值、温度和离子强度等环境条件有关，因此，在分析多酚对于MP的修饰效果时，应当结合各种条件，运用多种分析方法综合分析判断。

表4 多酚-肌原纤维蛋白相互作用对蛋白质功能性质的影响Table 4 Effects of interaction with polyphenols on functional properties of myofibrillar proteins

3.3.2 多酚-肌原纤维蛋白相互作用对蛋白质消化率的影响

大量研究表明，消化道中的多酚类物质对蛋白质的消化率有着不同程度的影响，一方面，通过与蛋白质结合，多酚可能潜在地影响某些氨基酸的可用性，也可能改变蛋白结构，从而影响蛋白质消化率和营养价值[108]；另一方面，食品体系中的多酚与蛋白质的相互作用会影响复合物的溶解性，从而对蛋白质的生物利用度造成影响[109]。体外研究表明，多酚可以与消化酶相互作用，改变其活性位点的化学环境从而抑制酶活力[110]。另外还有研究发现，茶多酚添加量在0.12%以下时对消化酶活力影响不大，而当添加量进一步增加时，胃蛋白酶活力骤减[111]，因此多酚与消化酶的相互作用还受到多酚浓度的影响。总的来说，多酚与蛋白质的共价作用会抑制消化酶活力以及形成不可消化的蛋白质，从而降低蛋白质的营养价值。

关于多酚对于MP消化率影响的研究主要集中在两个方面，即多酚-蛋白相互作用对生蛋白消化率的影响以及对蛋白凝胶消化率的影响[16]。Xu Mingfeng等[42]研究了表儿茶素处理对猪MP消化率的影响，结果表明胃消化30、60 min和肠消化90 min时的蛋白质消化率均有差异，但在肠消化120 min和180 min时却未观察到明显变化。说明表儿茶素与MP相互作用只会影响消化过程中的蛋白消化率，而消化过程结束之后的消化率没有显著变化。Cao Yungang等[103]研究发现，经胃蛋白酶-胰酶消化后，所有热诱导MP凝胶的消化率均在94%以上，说明MP凝胶易于消化。尽管在没食子酸结合的MP凝胶中形成了更多的二硫键和其他共价键，但总体而言，没食子酸处理对MP凝胶消化没有表现出明显的抑制或者促进作用。一般来说，消化率显著降低与酶靶向氨基酸残基的广泛聚集或者实质性破坏有关，而在此研究中并没有发现这些现象。Chen Jinyu等[91]研究表明，10 µmol/g表没食子儿茶素的添加对MP消化率无显著影响，而提高了其消化速度。但当含量为100 µmol/g时，消化率和消化速度均显著降低，这可能是因为低含量的酚类化合物可以提高蛋白质的表面疏水性，从而暴露了胃蛋白酶的可用切割位点，而高含量时会引起MP过度聚集，屏蔽之前的展开效应，导致蛋白水解敏感性降低。在MP与多酚的相互作用中，赖氨酸与精氨酸具有最高的加成量和反应效率，并且这些氨基酸残基更容易与多酚中的醌基发生共价反应，这解释了多酚对于MP体外消化的巨大影响。

4 结 语

MP在加工贮藏过程中极易发生过度氧化导致肉制品品质下降。有研究表明MP氧化与脂质氧化类似，也是一个ROS诱导下的自由基链式反应过程。多酚因具有清除自由基等能力而可以有效地抑制氧化反应的进行，此抑制作用受到多酚结构、种类、pH值以及离子强度等条件的影响。多酚与MP主要通过两种方式进行相互作用，即疏水相互作用、静电相互作用、范德华力和氢键等非共价相互作用以及“巯基-醌”和“氨基-醌”加成反应等共价相互作用。多酚-MP相互作用会对MP的二、三级结构以及MP的溶解度、表面疏水性、凝胶特性和乳化性等功能特性和消化性等营养特性产生显著影响。

就目前而言，对于多酚-MP相互作用的研究已经较为深入，但在一些领域仍然存在不足，需要继续深入探索。首先，虽然研究表明这两者相互作用会产生影响，但由于多酚种类、蛋白结构的不同，以及离子强度、pH值和温度等环境条件的差异，也因为研究者们各自研究目的与手段的不同，这些影响往往纷繁复杂，很难统一整理，甚至有时还会互相矛盾。其次，多酚对于MP消化率影响的研究虽然也有，但总的来说还不够深入。目前研究较多的是蛋白质作为载体通过与多酚相互作用阻止多酚在消化过程中抗氧化活性下降，而此过程中蛋白质消化率的变化却少有研究。此外，多酚与MP相互作用对于MP消化性的影响机制尚不明确，很多研究结果互相矛盾，这可能是由多酚结构与其他反应条件的不同导致的；因此，关于多酚与MP相互作用对于MP消化性的影响的理论体系还有待完善。最后，关于多酚和蛋白对于肠道菌群的影响方面的研究也较为广泛，但是研究这两者相互作用的复合物对肠道菌群影响的文章却少见报道。复合物是否会影响肠道菌群，会如何影响肠道菌群，还需深入研究。

除以上这些问题，通过添加多酚来增强MP膜的各项性能，以及对于多糖-多酚-MP三元复合物的研究也将是未来的研究方向。另外，虽然说将多酚作为天然抗氧化剂用于肉品保藏的研究已较为广泛，但就目前研究成果来看，对于多酚在较高剂量下的生物毒性研究还需深入，而且自然界还有很大一部分多酚类物质没有被开发利用，继续开发新的具有抗氧化能力的多酚类化合物也是热门的研究方向。