酿酒酵母异源合成柠檬烯的研究进展

胡智慧，李弘轩，郭学武,2，张翠英，肖冬光,*

（1.工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.中国轻工业浓香型白酒固态发酵重点实验室，四川 宜宾 644000）

萜类化合物是植物的一类次生代谢产物，主要由异戊二烯单元组成的化合物以及其衍生物构成。萜类化合物根据所含异戊二烯数目的不同可分为单萜化合物（C10）、倍半萜化合物（C15）、二萜化合物（C20）、三萜化合物（C30）、四萜化合物（C40）和多萜化合物（C10n）等[1]。多种萜类化合物已在医药、化妆品、食品等领域广泛应用，其中具有代表性的实例包括抗疟药青蒿素[2]（倍半萜）、香精原料檀香萜[3]（倍半萜）、抗癌药紫杉醇[4]（二萜）、抗菌药丹参酮[5]（二萜）、抗肿瘤药人参皂苷[6]（三萜）和抗氧化的番茄红素[7]（四萜）等。

柠檬烯属于单萜类化合物，化学式为C10H16。它主要存在于柑橘类（如柠檬、柑橘等）的果皮和果肉中，已被美国食用香料与提取物制造商协会（Flavor and Extract Manufactures Association of the Unite States，FEMA）认定其毒性属一般公认安全级，并已被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准食用[8]。柠檬烯化学结构内含有一个手性碳原子，所以有两种光学异构体，右旋柠檬烯（D-柠檬烯，如图1A所示）和左旋柠檬烯（L-柠檬烯，如图1B所示），此外还存在一种外消旋体（D/L-柠檬烯，如图1C所示）[9]。L-柠檬烯具有类似松油和松脂的芳香气味，而D-柠檬烯则具有类似柠檬或甜橙的香味，已被应用于香精领域，如作为添加剂添加到冰激凌、巧克力等中来调整口感；亦可在橙香、果香、柠檬等香型配方中作为修饰剂[10]；柠檬烯同时还具有防腐保鲜、抑菌、抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、祛痰平喘和利胆溶石等多种生理活性，因此已被应用于食品保鲜、医疗领域[10]。此外，柠檬烯的衍生物如紫苏醇、松油醇、香芹酮、香芹醇等也具有重要的应用价值[11]。

柠檬烯具有重要的生理功能和很高的应用价值，但其提取受植物季节性与提取工艺的限制，而合成生物学为更高效地获取柠檬烯提供了新思路。酿酒酵母具有遗传背景清晰、遗传改造技术成熟、存在甲羟戊酸（mevalonate pathway，MVA）途径等优势，已广泛作为合成萜类化合物的底盘微生物。本文主要回顾了近几年利用代谢工程改造酿酒酵母异源合成柠檬烯取得的成就，阐述了以酿酒酵母作为底盘微生物，利用代谢工程和合成生物学的手段提高柠檬烯产量的合成策略，还讨论了如何减轻柠檬烯对宿主细胞的毒性和提高宿主对柠檬烯的耐受性。

图1 D-柠檬烯（A）、L-柠檬烯（B）、D/L-柠檬烯（C）的化学结构式Fig. 1 Chemical structures of D-limonene (A), L-limonene (B),and D/L-limonene (C)

1 酿酒酵母中异源合成柠檬烯的研究进展

1.1 柠檬烯合成酶基因的克隆

虽然酿酒酵母中具有MVA路径，能合成柠檬烯的前体物，但是体内缺乏相应的柠檬烯合成酶，因此野生酿酒酵母不具有合成柠檬烯的能力。为了实现酿酒酵母异源合成柠檬烯的目标，需要引入外源的柠檬烯合成酶。迄今为止，研究者已经从不同的植物中分离得到了多种柠檬烯合成酶基因（表1），其中来自柠檬（Citrus limon）、蜜柑（Citrus unshiu）、橙子（Citrus sinensis）、薄荷（Mentha spicata）、白苏（Perilla frutescens）、荆芥（Schizonepeta tenuifolia）、藿香（Agastache rugose）、番茄（Solanum habrochaites）等中的柠檬烯合成酶已在大肠杆菌（Escherichia coli）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、产脂酵母（Rhodosporidium toruloides）、蓝藻（Anabaenasp）、蓝细菌（Synechococcus elongatus）等宿主中成功表达。

表1 多种植物中分离的柠檬烯合成酶基因及表达Table 1 Cloning and expression of limonene synthase genes from a variety of plants

1.2 酿酒酵母异源合成萜类化合物的研究进展

目前国内外已有很多科研工作者利用合成生物学的手段将萜类合成酶在酿酒酵母中进行表达，成功实现异源合成植物特有的萜类化合物。表2列举了近几年利用酿酒酵母异源合成植物萜类化合物的实例，主要通过代谢工程的手段过量表达萜类合成途径中的限速酶、全局转录因子，强化萜类合成代谢通量；采用氨基酸抑制型启动子、铜离子抑制型启动子、弱启动子等替换合成萜类化合物前体物的竞争路径中关键基因的启动子，弱化其表达的同时减少合成萜类化合物前体物的过度消耗；从植物中筛选或者挖掘高活性和专一性的萜类合成酶或者采用蛋白质工程策略，对萜类合成酶进行定向进化，从中筛选出高催化活性的萜类合成酶，为进一步提高萜类化合物的产量奠定基础。

表2 近年来通过改造酿酒酵母生产植物萜类物质的研究进展Table 2 Recent progress in the production of plant terpenoids by engineered Saccharomyces cerevisiae

2 酿酒酵母中异源合成柠檬烯的策略

酿酒酵母中异源合成柠檬烯的策略如图2所示，主要集中在柠檬烯合成路径的改造与优化，上游主要是通过引入外源基因改造和强化原有的乙酰-CoA代谢路径或者构建新的乙酰-CoA代谢路径，从而提高乙酰-CoA的供应量；中游主要是通过过量表达或者组合表达MVA途径中的限速酶、甾醇合成的全局转录因子（编码基因upc2-1）等措施强化MVA的代谢通量，其次就是引入外源基因构建新的代谢路径，减少碳的流失和降低能量、还原力的消耗，进而建立柠檬烯合成的最佳代谢路径，最后就是强化柠檬烯合成过程中还原型辅酶II（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的供应，提供充足的还原力；下游主要是弱化竞争路径，减少柠檬烯合成底物的流失，其次就是将柠檬烯合成酶融合表达及柠檬烯合成路径中酶的亚细胞定位表达等策略，进一步提高柠檬烯合成酶的催化效率。总之，这些合成策略将为柠檬烯的合成和其他萜类化合物的异源合成提供新的思路和参考。

2.1 柠檬烯合成路径的改造及优化

2.1.1 强化乙酰-CoA供应量

图2 代谢工程改造酿酒酵母异源合成柠檬烯的策略Fig. 2 Strategic diagram of metabolic pathways for the heterologous production of limonene in S. cerevisiae

酿酒酵母中乙酰-CoA主要来源于线粒体的丙酮酸脱氢酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）途径，其次来源于细胞质基质内的PDH旁路途径。乙酰-CoA作为三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环的起始化合物以及各种生物合成途径的关键前体，对维持细胞生长和发挥功能至关重要。柠檬烯的合成路径构建于细胞质基质内，其合成也需要大量的乙酰-CoA，即每合成一分子柠檬烯，需要消耗6分子乙酰-CoA，然而酵母体内又缺少将大量的乙酰-CoA从线粒体中转运到细胞基质内的转运蛋白，因此细胞质基质内的乙酰-CoA含量对柠檬烯的合成至关重要。目前，科研工作者已通过多种措施调控和改造酿酒酵母细胞质基质中的内源代谢途径或者引入外源的代谢路径来提高乙酰-CoA的供应量，同时减少能量和辅酶NADPH的消耗（图2），其中包括细胞质基质内重新构建PDH旁路，替换原有高耗能、反馈抑制强的PDH代谢旁路，从而提高了乙酰-CoA的利用率[42-44]；引入Mus. musculus异源的ATP-柠檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase，ACL）途径，将线粒体内的柠檬酸转运到细胞质基质内，增加乙酰-CoA的供应来源[45-46]；引入大肠杆菌的乙酰化乙醛脱氢酶（acetylating acetaldehyde dehydrogenase，A-ALD）途径，增加乙酰-CoA的供应量[47]；引入外源的磷酸转酮酶/磷酸转乙酰酶（phosphoketolase/phosphotransacetylase，PK/PTA）途径，不仅增加了乙酰-CoA的供应量，还减少了能量和辅酶的消耗[48]；引入大肠杆菌的PDH路径，不仅增加了乙酰-CoA的供应量，还增加了辅酶NADPH的供应[49]。

2.1.2 调节MVA途径的代谢通量及路径的优化

酿酒酵母的MVA途径涉及多步反应，其中含有多个限速酶，只有解除限速酶的约束才能实现流向底物的代谢通量最大化，但很难通过过量表达限速酶等单一调控手段实现MVA途径的代谢通量最大化，因此可采取过量表达甾醇合成的全局转录因子基因upc2-1，全局调控MVA途径的代谢通量[2]（图2）；对外源基因进行密码子优化、梯度调控启动子强度[50-51]、调节核糖体结合位点（ribosomebinding site，RBS）结合强度[52]等方法过量表达或者组合过表达MVA途径的关键基因tHMGR、IDI1、ERG12，进而达到强化MVA途径的通量和积累足够GPP的目的[39,53]（图2）；过量表达tRNA合成的负调控因子基因MAF1，减少异戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）被分流，强化IPP和二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）流向GPP[54-55]（图2）。柠檬烯的前体物（IPP/DMAPP）合成需要大量的ATP和辅酶NADPH，这对宿主的能量代谢和辅酶供应提出了更高的要求，同时也直接影响着目标产物的产量及产率。为了解决能量与辅酶供应的问题，科研工作者引入外源基因构建多个新的代谢路径，减少了碳的流失并降低了能量、还原力的消耗，进而建立柠檬烯合成的最佳代谢路径。各个路径的碳流失、能量和辅酶的消耗如表3所示。

表3 酿酒酵母中通过4种路径合成IPP和DMAPP之间的差异Table 3 Comparison of four pathways for the generation of IPP/DMAPP in yeast

2.1.3 强化辅酶NADPH的供应

酵母细胞内氧化型辅酶I（NAD＋）/还原型辅酶I（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、氧化型辅酶II（NADP＋）/还原型辅酶II（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）等辅助因子对是电子传输链的重要组成部分，至少参与800种生化反应，其中辅因子水平（氧化态/还原态之间的比率）直接影响着代谢路径的通量及目标产物的合成，因此可以通过辅酶工程强化细胞中辅因子水平，驱动代谢通量朝着目标产物的合成方向。酿酒酵母中脂肪酸的生物合成需要大量的辅酶NADPH，强化转氢酶体系和戊糖磷酸途径可提高细胞质基质内NADH转换成NADPH的转换量，进而提高脂肪酸的合成量[59]。酿酒酵母中那可汀（Noscapine）的生物合成也会消耗大量的NADPH[60]，Li Yanran等[61]通过过表达酵母自身的NADH激酶、3种异柠檬酸还原酶、丙酮酸脱羧酶、预苯酸脱氢酶、乙醛脱氢酶和NADP依赖性甘油脱氢酶，从而可以显著地提高NADPH的供应和那可汀的产量。3-羟丙酸（3-hydroxypropionic acid，3-HP）的合成也需要大量的NADPH，Chen Yun等[62]通过过表达异源NADP＋依赖的三磷酸甘油醛脱氢酶可以使酿酒酵母中的3-HP产量提高30%。辅酶NADPH作为柠檬烯异源合成过程中主要的辅酶因子，其持续高效的供应能力决定着柠檬烯合成路径的代谢通量，因此，提高辅酶NADPH供应能力对提高柠檬烯及其他萜类化合物的产量至关重要，具体措施如图3所示。

图3 辅酶工程强化柠檬烯及萜类化合物的合成效率Fig. 3 Cofactor engineering to enhance biosynthetic efficiency of limonene and terpenoids

2.1.4 弱化竞争路径与关键酶的融合表达

GPP合成酶是一种双功能酶（GPP合成酶/FPP合成酶），不仅能催化一分子IPP和一分子DMAPP生成一分子GPP，又能继续催化一分子GPP和一分子IPP生成一分子FPP，然而连续的反应限制了游离GPP的积累和柠檬烯的合成，因此提高GPPS的活性，减少GPP流向FPP，进而增加游离形式的GPP数量，这将有助于进一步提高柠檬烯的产量。FPP对细胞膜形成及细胞的生长至关重要，因此不能敲除ERG20基因，只能采取弱化FPP活性的策略来提高GPP的数量，即GPP合成酶Erg20p的单突变体（K197G、S、C、D、T、E）[63-65]和Erg20p的双突变体（F96W-N127W）[39-40,66-67]对GPP的亲和力高于FPP，弱化了GPP被分流到FPP，进而更利于GPP的积累和柠檬烯的合成。Schilmiller等[68]从番茄（Solanum lycopersicum）中发现了NDPS1，其可催化IPP和DMAPP形成NPP（GPP的顺式异构体），同时也揭示了以NPP和GPP作为底物合成不同单萜化合物的路径，其中D-柠檬烯、α-松油烯、α-蒎烯等单萜化合物的合成均可采用NPP、GPP作为底物，但以NPP作为底物的合成路径短于GPP，表明NPP是最佳底物；而罗勒烯、月桂烯、芳樟醇等单萜化合物的合成不能以NPP作为底物，只能以GPP作为底物。Kumar等[69]也对D-LS进行了酶动力学分析，表明NPP是D-LS的最佳底物。Cheng Si[39]和Hu Zhihui[41]等已在酿酒酵母中建立了NPP作为柠檬烯合成最适底物的新合成路径。

在萜类化合物异源合成过程中常采用代谢工程的方法强化关键基因的表达或者改变关键酶的活性，但是目前这些方法往往不能够使代谢通量最大化地流向目标产物，而酶融合表达被认为是提高酶的催化效率和萜类化合物产量的有效策略[40,53]。在利用酿酒酵母、大肠杆菌等微生物细胞工厂异源合成萜类化合物的过程中，代谢路径中会存在多个顺序酶催化，即一个酶的催化产物是下一步酶的催化底物，而当萜类合成酶在宿主内成功表达后便构成新的顺序酶催化，游离状态的萜类合成酶与底物在空间上的距离难以控制，这就制约了外源酶的催化效率[70]。采用融合酶的表达方式将代谢路径中的萜类合成酶与一个或者多个顺序酶串联融合表达，把不同酶的功能整合到一个融合酶中，通过控制其空间靠近效应，进一步提高酶的催化效率，达到提高萜类化合物产量的目的。为了避免融合酶的不同结构域在折叠、催化过程中存在的相互干扰，在融合酶的构建过程中需要引入柔性连接肽或者蛋白支架[71]，进而适当地保持酶与酶之间的距离。通过改变酶与酶之间的空间组织关系，一般指融合方向和连接肽，能够在空间上缩短酶与酶、酶与底物之间的距离，增加酶与底物的局部浓度，减少其他代谢物的干扰，同时减少中间产物的扩散和被竞争路径所利用，进而提高融合酶的催化效率[72]。线粒体是酿酒酵母中独立的亚细胞结构，具有乙酰-CoA、ATP供应充足等优势，可作为萜类化合物合成的第二场所。Yee等[73]已将香叶醇的合成路径定位于酵母的线粒体中，提高了香叶醇的产量。目前柠檬烯合成途径尚未在线粒体中构建，今后的研究可将柠檬烯合成途径的酶整体定位于线粒体中表达，再结合细胞质基质内的柠檬烯合成途径，同时调控基质和线粒体的柠檬烯合成途径，进而达到提高柠檬烯产量的目的。近年来采用酶的融合表达与定位的策略，改造酿酒酵母异源合成萜类化合物的实例如表4所示。

表4 酶的融合表达与亚细胞定位表达Table 4 Fusion expression and subcellular localization of enzymes

2.2 柠檬烯转运蛋白及耐性蛋白的挖掘

柠檬烯等萜类化合物在酿酒酵母中过量的积累会对其自身产生毒害作用，进而影响其生长及发酵性能。为了减弱柠檬烯对酵母持续的毒害作用，通常在发酵过程中加入有机溶剂（正己烷、十二烷、十四酸异丙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异壬酯等），进而将发酵液中的柠檬烯萃取出来，双相发酵可以有效地减弱柠檬烯对酵母的毒害作用[53,75]。研究如何提高酵母菌株快速转运柠檬烯到细胞外或者增强酵母耐受柠檬烯的能力，将有助于进一步缓解柠檬烯对细胞的伤害及提升柠檬烯的合成量。Ro等[76]研究发现在青蒿酸的胁迫下酿酒酵母体内的ABC转运蛋白有助于提高菌株耐受青蒿酸的能力。酿酒酵母中有31种ABC转运蛋白（表5）[77-78]，这些转运蛋白一般具有相似的分子结构和功能，主要负责不同物质的转运，其中也包括对细胞生长有毒的物质。值得注意的是，这些转运蛋白除了主要分布在细胞膜外，似乎每个细胞区室都含有一个或者多个不同的ABC转运蛋白。Wang Ye等[78]报道了在酿酒酵母中异源表达了来源于Grosmannia clavigera的ABC转运蛋白GcABC-G1，分别提高了酵母耐受(＋)-3-蒈烯、D-柠檬烯和β-蒎烯的能力。乳酸克鲁维酵母（K. lactis）、酿酒酵母（S. cerevisiae）、解脂耶氏酵母（Y. lipolytica）等菌属中也有与转运蛋白GcABC-G1相似的转运蛋白ABC-G1，其中酿酒酵母中含有ScABC-G1的转运蛋白为Pdr5p、Pdr10p、Pdr15p。Hu Zhihui等[41]利用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR）技术在低、高浓度D-柠檬烯胁迫下检测了10种转运蛋白的表达量，根据表达量之间的差异筛选出对D-柠檬烯浓度差响应最为显著的转运蛋白，并发现在低质量浓度（42.1 mg/L）D-柠檬烯胁迫下过量表达转运蛋白Pdr5p和Pdr15p基因能显著地提高重组菌株对D-柠檬烯的耐受性，其中转运蛋白Pdr15p对D-柠檬烯的耐受性能力强于Pdr5p。

表5 酿酒酵母中ABC转运蛋白的分布Table 5 Subfamily distribution of ABC transporter proteins in Saccharomyces cerevisiae

3 结 语

随着合成生物学和代谢工程的发展，实现了在酿酒酵母中构建柠檬烯合成途径的目标，但目前柠檬烯的产量远远不能满足市场化需求。为了进一步提高柠檬烯的产量，可以从以下4 个方面进行深入研究：1）柠檬烯合成需要大量的辅酶NADPH和能量，因此其合成途径的进入会干扰酿酒酵母原有的代谢网络，如何调整酵母体内新代谢网络的代谢平衡（氧化还原平衡、能量供应）及保持代谢流朝着柠檬烯合成方向，是采取过量表达MVA路径中限速酶、强化磷酸戊糖途径等措施强化原有代谢路径的代谢通量和辅酶供应，还是引入外源基因改造原有代谢路径或者构建新的代谢路径等措施增加代谢通量与底物供应，达到减少碳源的流失及节约能量和辅酶消耗的目的，进而重新调控新的代谢网络以达到最佳的状态；2）如何从其他生物体内挖掘到更高活性、特异性的柠檬烯合成酶或者对柠檬烯合成酶的催化机理进行全面、深入的研究，进而对柠檬烯合成酶采取酶定向进化的措施筛选到更高催化活性、专一性的柠檬烯合成酶，这将进一步为柠檬烯商业化及其他萜类化合物的应用提供理论基础；3）柠檬烯对酵母的生长具有毒害作用，目前双相发酵可以有效地减弱其毒性，但仍不能满足工业化的需求。如何构建一株高产柠檬烯、耐高浓度柠檬烯的酵母菌株，这对于柠檬烯商业化具有重要意义，然而柠檬烯的转运机制及耐性机理的研究不是很充分，这些限制了柠檬烯的异源高产。转录组学、蛋白质组学以及代谢组学等的快速发展使得在酿酒酵母中挖掘出与柠檬烯转运有关的转运蛋白和提高耐性的蛋白成为可能；4）菌株发酵控制对提高柠檬烯产量有着同样至关重要的作用，如何根据菌株高密度生长及发酵特性适时调整发酵策略是关键，对发酵过程中碳源、萃取剂、溶氧、pH值等进行优化与调控，以及对发酵尾气多级回收等均可实现提高柠檬烯产量的目的。综上所述，结合代谢工程和合成生物学构建高产柠檬烯菌株和发酵控制等多种手段，将有望实现柠檬烯及其他萜类化合物在酿酒酵母中定向、高效的异源合成。