乳酸菌代谢低聚果糖/菊粉途径及机理的研究进展

赖鲸慧，祝元婷，陈 媛，唐 林，陈贵希，李建龙，刘书亮,3,*

（1.四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014；2.四川师范大学生命科学学院，四川 成都 610066；3.四川农业大学食品加工与安全研究所，四川 雅安 625014）

低聚果糖（fructooligosaccharides，FOS）是由β-D(2→1)果糖基连接、末端有（或没有）一个葡萄糖分子的碳水化合物，聚合度（degree of polymerization，DP）为2～10，分子式为GFn或FFn（G表示葡萄糖，F表示果糖基，n表示果糖基数）[1]。菊粉也称菊糖，是由D-呋喃果糖分子以β(2→1)键连接而成的线性直链多糖，末端常带一个葡萄糖残基，常表示为GFn，DP一般在2～60。根据平均DP不同可分为3种：短链菊粉（DP≤10）、天然菊粉（2≤DP≤60）和长链菊粉（DP≥23）[2]。FOS和菊粉是研究最为广泛的益生元，大量体内外实验表明其可以选择性调节肠道微生物，有助于宿主健康。

合生元又称合生素，指益生元与益生菌结合使用的生物制剂（微生态制剂），具有益生功能及治疗多种疾病的作用[3]。合生元可分为互补性合生元和协同性合生元。互补性合生元要求益生元和益生菌能产生益生效应，产生的影响是其中每个组分有益影响之和。协同性合生元各成分除应具有益生效应外，益生菌还应具有代谢益生元的能力。这是协同性合生元最大的优点，即益生元可为益生菌提供营养，赋予它与其他肠道微生物竞争的优势，使得其在肠道定植和长期发挥益生作用成为可能。

乳酸菌属于益生菌，是人体肠道菌群重要组成部分，具有多种益生功能，如代谢产生的短链脂肪酸、细菌素、过氧化氢可抑制或杀死肠道内的有害菌，维持肠道微生态平衡[4]。乳酸菌细胞内碳水化合物活性酶存在特异性[5]，对益生元的利用也具有特异性，因此，了解不同乳酸菌对FOS和菊粉的代谢情况可为合生元（特别是协同性合生元）的研究提供菌种资源，明确乳酸菌代谢FOS和菊粉的机制有利于合生元研究。本文对乳酸菌对FOS和菊粉的代谢能力差异、代谢途径以及主要的代谢调控机制进行综述，总结近年来FOS/菊粉合生元的应用，以期为益生元与益生菌进一步联用提供参考依据，同时展望了未来的研究方向。

1 乳酸菌对低聚果糖和菊粉代谢能力的差异

FOS和菊粉被广泛用于评价乳酸菌的益生功能。常以FOS或菊粉代替MRS培养基中的葡萄糖，观察乳酸菌能否生长或能否达到在MRS培养基生长时的生物量。表1总结了近年来部分能利用FOS/菊粉的乳酸菌。能代谢FOS和菊粉的乳酸菌种类多样，以乳杆菌属和双歧杆菌属为主，乳杆菌对菊粉的利用较双歧杆菌更常见。此外，乳酸菌与FOS和菊粉存在着特异性代谢关系，有的乳酸菌对FOS和菊粉均能代谢，如Lactobacillus paracaseiI321、L. caseiL1等，而Bifidobacterium longumB2a、B. bifidumB6A仅能代谢FOS[6]。

表1 近年报道的能代谢FOS/菊粉的乳酸菌Table 1 Overview of lactic acid bacteria capable of metabolizing FOS/inulin

乳酸菌在代谢FOS和菊粉时，对DP有不同偏好性。当FOS（DP为4）和长链菊粉（DP＞23）共同作为碳源时，L. paracaseisubsp.paracasei8700:2优先代谢FOS，且不受FOS的DP影响[20]。类似地，B. longumBB536会先代谢scFOS）[21]。然而L. delbrueckiiTU-1、L. delbrueckiiJCM 1002T会优先利用DP较高的FOS[22]。于双歧杆菌而言，目前普遍认为其优先代谢低DP的FOS[21]。综上所述，不同种类乳酸菌对不同DP的FOS的利用存在先后差异，因此代谢方式可能不同。

2 乳酸菌代谢低聚果糖和菊粉的途径

通过薄层色谱法和高效液相色谱法检测发现L. paracasei1195在用FOS替换葡萄糖的改良MRS培养基中生长时，培养液中果糖、蔗糖含量会短暂增加，细胞提取物没有FOS水解酶活性[10,23]。在L. plantarumP14和P76的无细胞上清液和细胞壁提取物中检测到了水解酶活性，在细胞质部分未检测到[24]。相反，L. plantarumWCFS1培养液中未发现单糖和二糖的积累[25]，为此研究者们提出两种乳酸菌代谢FOS的途径。

2.1 水解转运途径

水解转运途径即先水解后转运的途径，对L. paracaseiDSM 20020[22]、L. paracaseiDSM 23505[26]、L. caseiIAM 1045[27]和L. plantarumP14、P76[24]等而言，FOS先在胞外被水解酶水解，然后一个或多个转运蛋白将水解产物（果糖、蔗糖和葡萄糖）转运进入胞内。以L. plantarumP14[24]为例分析其代谢过程：GFn和FFn型FOS或菊粉在胞外β-果糖苷酶作用下水解为果糖和scFOS，分别通过果糖和蔗糖磷酸转移酶系统（phosphotransferase system，PTS）转运系统进入细胞。即一方面scFOS在蔗糖PTS转运系统作用下穿过细胞膜并被磷酸化，再在蔗糖-6-磷酸水解酶（也称作β-果糖苷酶）作用下水解成6-磷酸葡萄糖和果糖，6-磷酸葡萄糖再在磷酸己糖异构酶的作用下转化为6-磷酸果糖，果糖在果糖激酶作用下生成6-磷酸果糖，随后进入糖酵解途径（图1）。另一方面，胞外果糖通过果糖PTS转运系统后被磷酸化，在磷酸果糖激酶作用下生成1,6-二磷酸果糖继续进行糖酵解。

2.2 转运水解途径

转运水解途径即先转运再水解的途径，如L. acidophilusNCFM[28]、L. delbrueckii[22]、L. plantarumST-III[29]以及L. plantarumWCFS[25]等是先通过转运系统将FOS转运进胞内，再在胞内水解酶作用下水解成单糖后被利用。双歧杆菌多以此方式代谢FOS，如B. breveUCC2003[30]、B. adolescentisG1[31]、B. lactisDSM 1014[32]。以L. plantarumWCFS1[25]为例分析其代谢过程：乳酸菌通过蔗糖PTS转运系统摄取胞外蔗糖或scFOS并将其磷酸化，接着胞内果糖苷酶作用于葡萄糖和果糖之间糖苷键生成果糖和葡萄糖-6-磷酸；果糖在果糖激酶作用下磷酸化成果糖-6-磷酸，最后进入糖酵解途径（图1）。有研究表明，转运蛋白能力会随FOS的DP增加而显著减弱，因此，高DP的FOS、菊粉是通过先水解再转运的方式被代谢[25,29]。但Tsujikawa等[22]发现L. delbrueckiiTU-1的转运系统可直接将高DP菊粉型果聚糖转运到胞内。因此，推测L. delbrueckiiTU-1代谢菊粉的途径是先转运再水解。

图1 乳酸菌代谢FOS的途径[25]Fig. 1 FOS catabolic pathways of lactic acid bacteria[25]

3 乳酸菌代谢低聚果糖和菊粉的分子机制

由上述乳酸菌代谢FOS途径可知，水解酶和转运系统在代谢过程中至关重要。许多研究表明水解酶和转运系统的编码基因一般位于同一个编码FOS代谢的基因簇中，还包括相应调控因子基因。表2归纳了预测到的在一些菌株中与FOS或菊粉代谢相关的基因簇。粉乳酸菌在代谢FOS或菊时，可能会有多个相关基因簇参与。Saulnier等[25]比较L. plantarumWCFS1在MRS培养基和改良MRS培养基（葡萄糖替换为FOS）中基因表达情况，发现位于同一基因簇中分别编码果糖激酶（sacK1）、蔗糖PTS转运系统（pts1BCA）、β-果糖苷酶（SacA）、转录调节蛋白（SacR）和α-葡萄糖苷酶（Agl）基因的表达明显增强。Goh等[23]运用微阵列分析发现一个由编码转录调控蛋白（fosR）、果糖/甘露糖特异PTS转运系统（fosABCD）、假定蛋白（fosX）和β-果糖苷酶（fosE）基因组成的fosRABCDXE操纵子参与了L. paracasei1195对FOS的代谢。Buntin[24]和Chen Chen[29]等发现L. plantarumST-III对FOS的代谢以及L. plantarumP14和L. plantarumP76对菊粉的代谢都有2 个相关基因簇参与。

表2 乳酸菌对FOS和菊粉代谢相关的酶及基因簇Table 2 Gene clusters and enzymes involved in metabolism of FOS and inulin in lactic acid bacteria

3.1 基因簇编码蛋白

3.1.1 水解酶

与FOS和菊粉代谢相关水解酶有多种，均属于GH32家族，如β-果糖苷酶（EC 3.2.1.26）[33-34]、菊粉酶（EC 3.2.1.7）[35-36]、果聚糖酶（EC 3.2.1.65）[35]和果聚糖β-果糖苷酶（EC 3.2.1.80）[26,37]等。许多研究者从分子水平证实了果糖苷酶对FOS的水解作用。如Chen Chen等[29,38]通过转录组分析发现了参与L. plantarumST-III代谢FOS的果糖苷酶（编码基因为sacA），并用基因敲除实验证明果糖苷酶独立负责FOS水解，sacA基因在大肠杆菌和L. rhamnosusGG的成功表达也进一步证实了果糖苷酶对FOS的水解作用。由于代谢途径存在胞内水解和胞外水解，水解酶也有胞内外之分，FOS胞外酶最典型特征是N端包含信号肽，C端有细胞壁的锚定位点LPQAG[23-24,39]。

通过分析酶水解产物和动力学常数发现，不同酶作用的糖苷键种类以及酶切位点有所不同，而且同一种酶在不同菌株中对底物的活性都存在差异。如菊粉酶是内切菊粉β(2-1)糖苷键，形成DP 3～6的FOS，果聚糖β-果糖苷酶却作用于非还原末端的糖苷键，释放果糖[40]。Ryan等[30]发现B. breveUCC 2003的果糖苷酶能够催化裂解蔗糖或低DP的FOS中葡萄糖与相邻果糖分子间的β(2-1)糖苷键，并且水解蔗糖时活力最高，然而B. lactisDSM 10140T果糖苷酶是裂解末端果糖之间的β(2-1)糖苷键，作用于FOS时活力高于蔗糖[30,32]。因此水解酶酶切位点的不同将会影响水解产物种类及比例，这可能会影响乳酸菌代谢FOS过程中参与的转运蛋白种类。

研究表明果糖苷酶的底物特异性取决于其晶体结构。果糖苷酶三维结构具有典型的GH32家族蛋白结构特征：N端为含有催化位点的β-螺旋桨结构域（包括5 个β-折叠保守区域），C端为与底物结合有关的β-三明治结构域，酶活性中心位于β-螺旋桨结构的中心区域，Asp-63位点充当亲核试剂，Glu-234位点作为广义酸碱（图2）[41-42]。据报道，通常果糖苷酶催化水解底物的机理是：Glu为底物氧原子提供质子，Asp作为亲核体攻击底物果糖残基的异头C-2碳原子，形成了果糖残基-共价酶复合物，同时底物其余残基被释放，然后Glu从水分子中夺走一个质子（作为广义碱）使得羟基取代酶-果糖残基复合物的果糖残基，从而释放果糖使酶活性中心恢复[43]。此外，Mendoza-Llerenas等[44]认为β-螺旋桨结构域中拥有开放式漏斗状通道的果糖苷酶比仅有一个空洞的果糖苷酶具有更广泛的底物选择性。

图2 β-果糖苷酶的三维结构[41]Fig. 2 Three-dimensional structure of β-fructofuranosidase[41]

3.1.2 转运系统

乳酸菌糖转运系统主要有4种：PTS、腺苷三磷酸结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporter，ABC）转运系统、透性酶、同向转运体[45]。就目前研究结果而言，蔗糖PTS和果糖/甘露糖PTS是参与乳酸菌代谢FOS和菊粉最常见的转运系统，如L. plantarumWCFS1[25]、L. paracasei1195[23]、L. plantarumP14和L. plantarumP76[24]等；也有少数乳酸菌是通过ABC转运系统和透性酶转运FOS或其水解产物，如L. acidophilusNCFM[28]、B. breveUCC2003[30]等。PTS由磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）依赖性蛋白激酶I（PEP-dependent protein kinase enzyme I，EI）、组氨酸磷酸载体蛋白（histidine-phosphoryl protein，HPr）以及糖特异性酶II复合物（enzyme II，EII）组成，其中前两者是无底物识别特异性的可溶性胞内蛋白，EII可特异性识别和转运底物分子，并且包含4 个结构域（EIIA、EIIB、EIIC和EIID），但有的不含EIID[46]。PTS是一种需能量的可逆浓度运输系统，碳源分子经过该系统转运后会发生构象变化（被磷酸化）。一般PTS转运过程为：HPr在EI的作用下接受来自磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸基团被磷酸化，接着依次将磷酸基团传递给EIIA、EIIB，然后胞外碳源分子经EIIC、EIID转运进胞内后接受磷酸基团成为磷酸化的碳源分子而被代谢[47]，其中EIIB的磷酸化和EIIC（EIID）的转运是紧密相连的[48]。

乳酸菌在代谢FOS时参与的转运系统可能不止1 个，如Chen Chen等[29]通过转录组分析和基因敲除实验证明SacPTS1和SacPTS2编码的蔗糖PTS转运系统均参与L. plantarumST-III对FOS的转运。Buntin等[24]发现L. plantarumP14、P76对菊粉的代谢有蔗糖PTS和果糖/甘露糖PTS转运系统的共同参与。此外，从表2中可以看出，只要是先水解再转运的菌株，其代谢过程中参与的转运系统均有果糖/甘露糖PTS，从现有收集到的文献推测，若乳酸菌在胞外水解FOS或菊粉，那么水解产物的转运由果糖/甘露糖PTS转运系统负责，如果是在胞内代谢FOS，那么参与的转运系统可能为蔗糖PTS或ABC转运或透性酶。

3.1.3 调控因子

目前已命名编码参与FOS代谢调控因子的基因有MsmR、fosR、sacR、LacIfos。B. breveUCC2003中LacIfos产物的N端与GalR-LacI家族中和DNA结合的区域具有明显相似性，即螺旋-转角-螺旋结构，C端则是与糖结合区域[30]。此外，通过NCBI网站查询到L. acidophilusNCFM、L. plantarumWCFS1、L. plantarumST-III调控因子是阻遏蛋白，分别为MsmR、SacR、SacR1；相反L. paracasei1195的调控因子FosR是转录激活蛋白。与FOS代谢相关的基因簇均受FOS或菊粉诱导，因此，探讨乳酸菌代谢FOS/菊粉的机制离不开对其代谢调控方式的总结。

3.2 乳酸菌对FOS和菊粉的代谢调控

3.2.1 局部调控

局部调控即局部转录因子在有或无诱导物存在时，与操纵基因作用调控结构基因转录。Chen Chen等[49]在排除葡萄糖引起的全局调控情况下，通过基因敲除实验证明编码转录调控因子的sacR1和sacR2对L. plantarumST-III代谢FOS具有局部调控作用。Francke等[50]在植物乳杆菌WCFS1中发现了参与蔗糖或FOS代谢的局部转录调控因子Lp_0188（sacR）。因此，鉴于L. plantarumST-III和L. plantarumWCFS1在诱导物（FOS）存在时，基因簇被诱导表达，且基因簇中调控因子产物为阻遏蛋白，推测其局部调控方式属于可诱导的负调控。即当FOS（诱导物）不存在时，阻遏蛋白与操纵基因结合，阻止结构基因转录；当FOS（诱导物）存在时，FOS与阻遏蛋白结合并从操纵基因上脱离，RNA聚合酶启动结构基因的正常转录。而对L. paracasei1195而言，诱导物（FOS）存在时，基因簇同样被诱导表达，但其基因簇中编码调控因子fosR的产物是激活蛋白，推测其局部调控方式属可诱导的正调控。即当FOS（诱导物）不存在时，激活蛋白以失活状态存在，无法与操纵基因结合，因此结构基因不转录；当FOS（诱导物）存在时，激活蛋白被FOS激活，与操纵基因结合开启结构基因的转录。此外Chen Chen等[49]通过电泳凝胶迁移实验和染色质免疫沉淀技术证明了L. plantarumST-III的转录调控因子SacR1和SacR2能与启动子区域的转录因子结合位点（transcription factor binding site，TFBS）以高亲和力进行特异性结合。

3.2.2 全局调控

除局部调控外，乳酸菌对糖的代谢调控往往还有全局调控。全局调控是由易被宿主利用的糖（如葡萄糖）所诱导的代谢调控蛋白A（catabolite control protein A，CcpA）与代谢反应元件（catabolite response element，cre）结合完成的。CcpA对碳代谢物的调控可分为碳代谢阻遏（carbon catabolite repression，CCR）效应和碳代谢物激活（carbon catabolite activation，CCA）效应[51]。cre是CcpA介导CCR效应的重要顺势调控元件[52]。革兰氏阳性菌中与CcpA结合的cre位点位置有所不同，有的位于启动子区域，也有位于启动子下游。有学者对L. plantarumST-III FOS代谢相关基因簇中潜在cre位点进行点突变并结合电泳凝胶迁移实验证明CcpA与其4 个启动子区域的6 个cre位点特异性结合[53-54]。这种直接与cre位点结合的方式为CcpA的直接调控，除此之外，CcpA还可通过间接调控来调控其他基因表达，即CcpA引起局部调控因子变化，从而使得受控于局部调控因子且启动子区域不含cre位点的基因也因此而发生变化。如卢艳青[55]通过分析CcpA基因敲除前后利用FOS和葡萄糖的差异转录组发现，有些已确定发生了显著变化的基因，其启动子区域却不含cre位点，推测这些基因可能受到CcpA间接调控。

在革兰氏阳性菌中CcpA主要起负调控作用，即主要为CCR效应，也称葡萄糖效应。比如L. paracasei1195在含低浓度葡萄糖的FOS环境生长时呈现典型二次生长现象，即葡萄糖先被利用，待葡萄糖利用完，FOS代谢相关基因才开始表达[23]。调控原理即：当葡萄糖等速效碳源存在时，胞内高水平ATP/Pi（ATP与无机磷酸比例）与葡萄糖代谢产物激活Hpr激酶/磷酸酯酶活性，将HPr的Ser46位点磷酸化，形成HPr-Ser46-P，然后HPr-Ser46-P与CcpA结合形成复合物，与非速效碳源（FOS）代谢基因簇启动子区域cre位点结合，抑制转录；当葡萄糖不存在时，His15被HPr磷酸化，HPr-Ser46-P将失去磷酸化反应，FOS被正常利用，抑制效果消失[23,56]（图3）。

图3 CcpA介导的CCR效应Fig. 3 Mechanism of CcpA-mediated CCR effect in lactic acid bacteria

因此，乳酸菌对FOS（或菊粉，下同）的代谢调控（全局＋局部）大致可分为4种情况（以阻遏蛋白为例）：仅葡萄糖存在、仅FOS存在、葡萄糖和FOS均不存在、葡萄糖和FOS都存在（图4）。只有葡萄糖时，局部调节基因产物（阻遏蛋白）与操纵基因结合，HPr-Ser46-P和CcpA结合形成复合物并与启动子区域cre位点结合，阻止FOS代谢相关结构基因的表达；只有FOS时，结构基因的转录没有CcpA复合物（即没有CcpA复合物与启动子区域的cre位点结合）抑制，阻遏蛋白与FOS（诱导剂）结合，从操纵基因上脱离，解除对FOS代谢相关基因的抑制；葡萄糖和FOS都不存在时，结构基因的转录同样没有CcpA复合物的抑制，阻遏蛋白与操纵基因结合抑制FOS代谢相关簇表达；葡萄糖和FOS都存在时，阻遏蛋白与FOS（诱导剂）结合，脱离结构基因，解除其对FOS相关基因簇启动子区域的抑制，但是这时全局调节因子CcpA与启动子区域cre位点结合，阻碍了RNA聚合酶与启动子结合，从而抑制FOS代谢相关基因的表达，即出现了CCR效应。乳酸菌对碳源的代谢调控非常复杂，有些基因只受局部调控因子作用，有的会受到全局调控和局部调控的双重作用，同时有的局部调控因子还受到全局调控的作用，因此这背后复杂的调控网络还亟待解析。

图4 乳酸菌对FOS（或菊粉）的代谢调控Fig. 4 Metabolic regulation of FOS (or inulin) by lactic acid bacteria

总的来说，乳酸菌对FOS/菊粉的代谢机制为：在诱导物存在或者不存在的情况下，乳酸菌基因组中与碳代谢相关的调控蛋白启动或抑制FOS/菊粉代谢相关基因簇的表达，即影响编码水解酶和转运蛋白基因的表达，进而实现对FOS或菊粉的代谢或不代谢。

4 低聚果糖或菊粉类合生元的应用

乳酸菌代谢菊粉或FOS的能力对于合生元（特别是协同性合生元）发挥生理作用起着重要作用。本文对近年来（2018ü2021年）关于菊粉/FOS合生元的报道进行了总结（表3）。研究表明菊粉/FOS合生元在对抗2型糖尿病的并发症、调节免疫以及改善肠道健康方面具有积极的影响。Kanjan等[9]对协同性合生元进行了体外研究，发现将L. paracaseiI321（能降解菊粉）和菊粉同时应用到粪便菌群时，菊粉使得L. paracaseiI321在粪便菌群的竞争环境中存活并占优势，同时其代谢过程分泌的胞外酶将菊粉水解为scFOS和果糖，刺激粪便中不能代谢菊粉但能代谢FOS的菌（乳杆菌和双歧杆菌）的生长，使这些菌协同抑制沙门氏菌的生长。

表3 近年关于FOS/菊粉合生元的应用研究Table 3 Recent applications of synbiotics containing FOS/inulin

5 结 语

本文综述了乳酸菌对FOS和菊粉的代谢能力差异，乳酸菌代谢FOS和菊粉的途径、代谢机制以及FOS/菊粉类合生元的应用等。目前乳酸菌代谢FOS和菊粉的两种途径已较为明了，即先转运再水解和先水解再转运，但是更为深入、清楚的代谢机制，尤其是调控机制还亟待解析。新技术手段的发展，特别是基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学的发展，将为代谢机制的解析提供更好的手段。此外，虽然益生菌/益生元单独使用均有益生效应，但是从实际应用以及长远发展来看，合理利用代谢机制促进FOS或菊粉更有效地被乳酸菌利用、赋予乳酸菌与其他微生物竞争的优势、开发科学健康的合生元（尤其是协同性合生元）产品将有望成为未来的热门课题。