益生菌磷壁酸引起的免疫反应研究进展

张铭书，夏永军，艾连中，熊智强，宋 馨，王光强

（上海理工大学健康科学与工程学院，上海食品微生物工程技术研究中心，上海 200093）

近些年，益生菌因有促进营养物质的消化吸收[1]、提高机体免疫力[2]、维持肠道菌群结构平衡[3]、抑制肠道炎症[4]等功能而被大家广泛研究。益生菌及其代谢产物可以通过影响非特异性及特异性免疫反应[5]、参与巨噬细胞极化[6]、调节黏膜屏障及免疫平衡[7]、帮助免疫微生态环境重建[8]，从而达到辅助治疗多种疾病的目的[9]。益生菌表面大分子物质是引起宿主免疫炎症反应的关键物质，磷壁酸在其中起到关键作用[10]。不同结构的磷壁酸会引起不同的免疫反应，研究表明致病菌磷壁酸可能与其致病性相关[11]，而益生菌中磷壁酸对免疫应答的影响具有不确定性。

因此，本文从细胞和分子水平对益生菌磷壁酸引起的免疫方应进行总结，并在此基础上对益生菌磷壁酸突变型菌株在调节免疫反应疾病、治疗和预防肠炎方面进行综述，旨在为益生菌治疗免疫相关疾病提供新的调控靶点和研究思路，并为后续深入研究磷壁酸的免疫调节机理提供理论参考。

1 益生菌磷壁酸的结构和合成路径

1.1 益生菌的免疫调控

益生菌是一类摄入适量时会对宿主健康产生有益作用的活性微生物的总称，可以调节树突细胞（dendritic cell，DC）[12]、单核细胞[13]、自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）[14]、调节性T细胞（T regulatory cells，Treg）和辅助性T细胞（T helper cell，Th）17[15]诱发的免疫反应，发挥其免疫调节能力[16-18]。近年来，研究发现益生菌与人类健康关系密切，它能影响肠道淋巴系统免疫功能并在一定程度上预防和/或治疗过敏性疾病[19-20]，婴儿早期肠道微生物群可能影响儿童食物过敏的发生，乳杆菌属和双歧杆菌属也可以作为治疗食物过敏的益生菌[21]。虽然传统的糖皮质激素和免疫抑制剂能够缓解病情，使患者存活率升高，但是长期使用会造成一系列不良后果[22]。目前大量临床试验、动物模型和体外研究发现，免疫系统的紊乱和失衡是引起自身免疫疾病发生和发展的主要原因，益生菌可以增强寄主的免疫功能，有效预防或治疗自身免疫性疾病[23]。相关研究发现革兰氏阳性菌细胞壁及细胞膜表面磷壁酸与机体产生免疫反应有极大相关性[10]，但是益生菌和致病菌所引起的炎症反应均不相同[24-26]，这与磷壁酸的结构有关，分析不同血清型金黄色葡萄球菌[27]、枯草芽孢杆菌[27]、粪肠球菌[28]、脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）结构和功能后发现，其LTA结构中的D-丙氨酸（D-alanine，D-Ala）支链的数量与其致炎作用呈正相关。但与致病菌相比，益生菌的磷壁酸不易引起炎症反应，对比植物乳杆菌和金黄色葡萄球菌的磷壁酸后发现两者的最大不同点之一是甘油-磷酸链的糖基取代物以及D-Ala支链的结构和数量。磷壁酸糖脂部分中酰基链的饱和程度（植物乳杆菌的不饱和脂肪酸）和数量（植物乳杆菌的第三酰基链）也与炎症反应产生相关。由此可见，甘油-磷酸（D-Ala和糖基的含量）和磷壁酸的脂链（酰基链的长度以及饱和程度）在磷壁酸发挥免疫刺激及调控方面具有重要作用[29]。

1.2 磷壁酸的结构、分类

磷壁酸是在革兰氏阳性菌中发现的一种重要的细胞壁聚合物。根据其与细胞的连接方式不同可为两类：LTA和壁磷壁酸（wall teichoic acid，WTA）[30]。WTA结构与LTA结构大致相同，但其糖脂锚定物结构不同，WTA主要在细胞壁上，LTA在细胞膜上[11]。LTA的结构不同所引起的免疫反应也不同，其结构大体分为3 个部分：修饰结构D-Ala支链、糖基和磷胆碱残基[31]。

在不同的革兰氏阳性菌中，LTA的结构也不同，共分为5种结构，其中I、II型磷壁酸多在益生菌中，III、IV、V型磷壁酸多存在致病菌中。聚甘油磷酸酯（I型）LTA具有未分支的1～3 个链接的甘油磷酸（glycerolphosphate，GroP）骨架结构，通常通过糖脂结构与细菌膜相连[32]。在GroP重复单元中C2位置的羟基在不同程度上会被D-丙氨酰或糖基修饰，是益生菌LTA的主要结构并且多存在于厚壁菌门中[31]。II型LTA具有α-半乳糖基（galactosyl，Gal）(1,6)-α-Gal(1,3)-GroP重复单元的骨架，其中GroP单元可以进一步被α-Gal残基取代。该聚合物通过α-葡萄糖（glucose，Glc）(1,2)-α-Glc(1,3)-二酰甘油（diacylglycerol，DAG）链式结构连接到膜上，第一个葡萄糖分子可以携带其他酰基链，多在益生菌中发现，如植物乳杆菌、双歧杆菌的LTA就是由糖脂、聚甘油磷酸链以及D-Ala支链、糖基支链构成（图1）。III型LTA具有α-Gal(1,3)-GroP-重复单元的骨架结构，并且通过β-氨基葡萄糖(1,3)-α-Glc(1,3)-DAG脂质连接到细胞膜上。GroP残基被N-乙酰氨基葡萄糖（25%）或氨基葡萄糖（50%）残基取代，主要在无害梭菌中发现。肺炎链球菌（IV型）LTA，其主链是由2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-D-半乳糖（AATGal）、Glc、核糖磷酸（ribitolphosphate，RboP）和两个N-乙酰氨基葡糖（N-acetylglucosamine，GlcNAc）残基重复单元组成[33]。V型LTA具有通过C-6连接的α-D-GlcNAc(1-3)-α-D-GlcNAc重复单元的骨架结构[34]，第二个N-乙酰氨基葡萄糖残基用D-甘油酸修饰，该聚合物通过β-1-6-连接的三葡萄糖酰甘油糖脂连接在细菌膜上，多存在于厌氧菌和艰难梭菌中[35]。

图1 植物乳杆菌LTA结构Fig. 1 Structure of lipoteichoic acid (LTA) from Lactobacillus plantarum

1.3 磷壁酸的合成路径

磷壁酸合成基因主要有脂磷壁酸合成酶（lipoteichoic acid synthase，LtaS）、糖基转移酶（glycosyltransferase，YpfP）、甘油二酯激酶（diacylglycerol kinase，DgkB）、磷脂酸胞苷转移酶（phosphatidate cytidyltransferase，CdsA）、磷脂酰甘油磷酸合酶（phosphatidylglycerol phosphate synthase，PgsA）和具有PgsA活性的未知酶[32]。

磷壁酸的糖脂结构二酰甘油（diacylglycerol，Glc2-DAG）在细胞的细胞质中由YpfP产生[36]，YpfP利用核苷酸激活的糖作为底物合成脂质，并由脂壁酸蛋白A（lipoteichoic acid protein A，LtaA）酶协助转移到膜外[37]。LtaS以脂质磷脂酰甘油（lipid phosphatidylglycerol，PG）为底物，通过在生长链的末端重复添加GroP残基来产生聚甘油磷酸酯链[38]，同时形成的DAG通过DgkB、CdsA、PgsA酶以及未知的具有磷脂酰甘油磷酸酶活性的酶在细胞质中催化循环从而继续生成PG[32]，在循环过程的第一步，DgkB将DAG转化为磷脂酸[39]。磷脂酸随后经CdsA、PgsA和一种或多种具有磷脂酰甘油磷酸酶活性的酶通过常规的磷脂酰肌醇合成途径将磷脂酰甘油磷酸转化为磷脂酰肌醇[32]。通过研究发现，LTA的合成主要依赖于Ltas合酶，研究金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌LtaS酶域的晶体结构发现，其主要作用于GroP的共晶结构，帮助脂质与酶的结合，是由I型信号肽酶在膜和细胞外酶域之间进行合成的[40]，LtaS的可溶性胞外结构域可以将PG水解为DAG，但该结构域的表达不足以合成LTA，只有全部的LtaS可在体内产生LTA[41]。尽管所有I型LTA都含有相同的GroP骨架，但参与其合成的LtaS的数量因细菌种类而异。并且只在单核细胞增生李斯特菌中发现了LTA合酶双酶系统[42]，LtaP将第一个GroP连接到糖脂锚上，之后由LtaS合酶延伸该链[32]。

2 益生菌磷壁酸的免疫调控机理

2.1 植物乳杆菌磷壁酸引起的免疫反应通路

植物乳杆菌磷壁酸是其细胞壁和细胞膜的主要组成部分，会引起各种免疫反应。Pam2CSK4（合成二酰脂肽-Toll样受体（toll-like receptor，TLR）2/6激动剂（S-[2,3-bis(palmitoyloxy)propyl]-Cys-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys））可以刺激人肠上皮Caco-2细胞产生白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）细胞因子，LTA可以通过抑制Pam2CSK4引起的TLR2活化以及p38激酶、c-Jun N-末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和核因子-κB（nuclear factor-κ-gene binding，NF-κB）转录因子的激活从而阻断IL-8的产生进而对人肠上皮细胞产生抗炎作用[43]。LTA通过A类清道夫受体（scavenger receptor class A，SR-A）通路刺激脾细胞吞噬植物乳杆菌，并诱导IL-12p40细胞因子产生[44]，LTA的D-Ala支链以及脂质部分可导致细胞外信号调节激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）、P38激酶磷酸化以及NF-κB的活性减弱，从而抑制poly（I∶C）（病毒双链RNA合成类似物聚I∶C）诱导猪小肠上皮细胞分泌IL-8细胞因子[45]，也可以激活TLR2依赖的ERK通路，从而刺激巨噬细胞IL-10/IL-12细胞因子产生的平衡，起到一定的抗炎效果[46]。LTA可以有效抑制由鞭毛蛋白刺激细胞产生的IL-8细胞因子，但是缺乏D-Ala支链和酰基支链的LTA不能抑制IL-8细胞因子的产生，这说明LTA的酰基部分对于抑制鞭毛蛋白诱导的IL-8产生至关重要，LTA在改善猪外周血单核细胞的抗炎反应中也起重要作用[47]。总的来说，植物乳杆菌LTA可刺激人肠上皮Caco-2细胞产生IL-8细胞因子，通过SR-A通路使脾细胞吞噬植物乳杆菌，进而诱导IL-12p40细胞因子产生，使ERK、P38激酶磷酸化以及NF-κB的活性提高，从而抑制肠上皮细胞分泌IL-8，激活TLR2依赖的ERK通路，保证巨噬细胞IL-10/IL-12产生的平衡，引起不同免疫反应通路并分泌不同细胞因子（图2）。

图2 植物乳杆菌LTA引起的免疫反应通路Fig. 2 Immune response pathways induced by LTA from Lactobacillus plantarum

2.2 双歧杆菌LTA引起的免疫反应通路

双歧杆菌LTA可以促进多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞的增殖并且降低其IL-17和IL-6的表达水平[48]，用LTA进行灌胃处理后，小鼠胸腺指数、脾脏指数、脾淋巴细胞增殖活性和NK细胞杀伤活性明显升高，表明LTA能够促进免疫器官的增殖发育。而血清IL-2和干扰素-γ（interferon-γ，INF-γ）水平明显升高，IL-10明显降低，说明LTA能够通过增强IL-2和INF-γ的分泌释放使机体免疫应答由Th0向Th1转化。Th1型细胞因子的分泌大大增加，促进胸腺和脾脏增生，增强脾淋巴细胞的增殖活性，提高NK细胞的杀伤活性，使Th1/Th2的紊乱得以纠正，从而提高了机体对白色念珠菌感染的抵抗力，具有良好的调节细胞免疫功能的作用[49]，但其也能通过激活小鼠腹腔巨噬细胞MEK/ERK通路促进肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表达。结果表明，双歧杆菌LTA可以促进多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞的增殖并且降低其IL-17和IL-6的表达水平，激发深部白色念珠菌感染小鼠Th1型细胞的应答，调节Th1/Th2的紊乱，但也会激活小鼠腹腔巨噬细胞MEK/ERK通路促进TNF-α的表达[50]。

2.3 其他益生菌LTA引起的免疫反应通路

酪酸菌LTA可抑制金黄色葡萄球菌LTA诱导的HT-29细胞炎症反应和凋亡以及NF-κB和ERK信号通路的激活，用LTA预处理也能够抑制IL-8和TNF-α等细胞因子的表达和释放[26]。干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌细胞壁表面LTA也可以有效抑制鞭毛蛋白诱导IL-8细胞因子的产生[47]。副干酪乳杆菌中的LTA可通过调节TLR2/p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/NF-κB途径增强黏蛋白（Muc2）的表达，从而减轻与年龄有关的肠漏和炎症[51]。保加利亚乳杆菌LTA可通过下调脂筏中淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（lymphocyte-specific protein-tyrosine kinase，LCK）水平从而抑制大鼠肝脏Kupffer细胞TLR4通路[52]。

3 益生菌磷壁酸缺失菌株在免疫调控，预防和治疗免疫性疾病方面的应用

3.1 植物乳杆菌磷壁酸以及磷壁酸支链缺失菌株预防、治疗免疫性疾病的作用

3.1.1 植物乳杆菌中磷壁酸D-Ala支链缺乏突变菌株引起的相关免疫反应

植物乳杆菌磷壁酸上D-Ala残基对长期缺乏营养果蝇的机体生长具有一定调节作用，相关研究人员通过筛选果蝇幼虫中植物乳杆菌的转座子插入文库，鉴定了pbpX2-dlt操纵子编码的细菌细胞壁的修饰机制，该机制对增强宿主消化能力和促进动物生长和成熟至关重要[53]。这个操纵子的缺失导致细菌细胞壁表面LTA的D-Ala支链缺失。结果表明，果蝇肠细胞直接接触植物乳杆菌细胞WTA上的D-Ala支链，以保证慢性营养不良时肠道肽酶的表达和活性，帮助幼体生长和成熟[53]。在体外（单核细胞刺激）和体内（结肠炎小鼠模型）研究中发现，植物乳杆菌D-Ala基因缺失突变体在磷壁酸生物合成途径中具有一定的抗炎特性。与野生型菌株相比，Dlt-突变体（LTA表面D-Ala支链大量减少）刺激的外周血单核细胞和单核细胞分泌的炎症因子明显减少并刺激了抗炎因子IL-10的产生，Dlt-突变体在小鼠结肠炎模型中具有更大的保护作用，而从植物乳杆菌中纯化的LTA刺激产生炎症因子的能力是具有TLR2依赖性的，以上结果说明植物乳杆菌LTA的组成可以引起炎症或抗炎免疫反应[54]。在其他研究中发现此突变菌株有调节由TLR3激活触发的肠道抗病毒先天免疫的能力，用LTA支链D-Ala基因敲除菌株刺激猪肠上皮细胞，评估其调节TLR3诱导的免疫反应的能力。用TLR3诱导剂poly（I∶C）对细胞的刺激显著上调了干扰素-β（interferon-β，IFN-β）、IL-6和单核细胞趋化蛋白（monocyte chemotactic protein，MCP）-1的表达。与poly（I∶C）处理相比，用突变型和野生型菌株处理的PIE细胞均显示出较高的IFN-β表达水平，而野生型菌株显著降低IL-6和MCP-1的表达。突变菌株处理的小鼠在poly（I∶C）诱导剂攻击后显示出更强的IFN-β水平。但是，用突变型菌株治疗的小鼠不能上调IL-10细胞因子的表达以及减少CD3＋、NK1.1＋、CD8 alpha alpha＋、细胞量和下调TNF-α、IL-6、IL-15的表达。这些结果表明，在TLR3诱导炎症的情况下，LTA支链上的D-Ala是诱导的抗炎作用的关键分子[55]。综上所述，植物乳杆菌磷壁酸D-Ala支链基因缺失突变菌株对预防、治疗肠炎以及免疫性疾病有一定的作用，但D-Ala支链也可以保证慢性营养不良的果蝇肠道肽酶的表达和活性，可以帮助幼体生长和成熟并且在TLR3诱导炎症的情况下，可以发挥一定的抗炎作用（图3）。

图3 植物乳杆菌突变体的免疫调节作用Fig. 3 Immune regulation by Lactobacillus plantarum mutants

3.1.2 植物乳杆菌细胞壁上的WTA缺乏突变菌株的抗炎作用机制

植物乳杆菌缺乏WTA突变菌株，在体外细胞实验中TLR2/6的NF-κB转录因子的表达量不显著，而野生型菌株与细胞共培养时，几乎没有TLR2/6的NF-κB转录因子的表达，这表明WTA虽不直接参与TLR2/6信号，但以一种独特的方式减弱这种信号，可能是通过影响LTA等免疫调节化合物的释放和暴露。当使用纯化的WTA时，人树突状细胞不分泌任何细胞因子，而与野生型相比，在WTA突变体刺激后，它们分泌的炎症细胞因子IL-12p70和TNF-α水平急剧下降[56]。

3.2 嗜酸乳杆菌LTA突变体的抗炎作用

嗜酸乳杆菌中，磷酸甘油转移酶基因在LTA生物合成中起关键作用，研究表明，与野生型嗜酸乳杆菌相比，不产生LTA的嗜酸乳杆菌可下调IL-12水平，而且还可下调TNF-α水平，显著增强了DC产生IL-10细胞因子的水平，增强其诱导激活CD4＋T细胞的能力。此外，不产生LTA的嗜酸乳杆菌能更有效地治疗结肠炎症[57]。IL-10依赖性途径是嗜酸乳杆菌LTA缺乏突变体保护作用的基础，并且与野生菌株相比，突变菌株会抑制TLR2通路，抑制P38磷酸化以及模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）的表达[58]。用LTA缺乏的嗜酸乳杆菌进行灌胃治疗可使先天和适应性致病免疫反应小鼠正常化，并导致结肠息肉消退，同时产生IL-10抗炎因子抑制微生物群和Tregs诱导的炎症。而肠道免疫反应，无论是刺激的还是抑制的，都是由活化的DC决定的，树突状细胞首先与微生物及其代谢产物相互作用，然后引发T细胞和B细胞反应。LTA与先天免疫细胞（包括树突状细胞）相互作用使其分化，同时激活抗炎CD4＋T细胞。这项研究揭示了LTA刺激产生炎症的作用和LTA缺乏的嗜酸乳杆菌在结肠息肉病小鼠模型中有调节炎症和保护结肠的能力[59]。

4 结 语

益生菌磷壁酸免疫反应通路的研究为后续益生菌磷壁酸缺失突变体治疗肠炎以及免疫疾病的研究奠定了一定的基础，因此研究磷壁酸产生的免疫反应通路是至关重要的。但在相关研究中发现磷壁酸既能引起炎症反应也会引起抗炎反应，如植物乳杆菌LTA可产生IL-8以及IL-12细胞因子，也可激活TLR2依赖的ERK通路，从而保证IL-10/IL-12产生的平衡。目前，对于益生菌磷壁酸免疫调控作用还存在争议，因此需要更加深入的研究。而益生菌磷壁酸突变菌株在治疗肠炎以及相关免疫疾病的研究相对较少，在不同的益生菌中使用了不同的磷壁酸缺失突变体，完全缺失LTA、缺失D-Ala支链以及缺失WTA都会产生不同治疗炎症的效果，益生菌磷壁酸到底引起什么样的炎症反应还需深入了解。研究发现，益生菌磷壁酸会引起机体炎症反应并且磷壁酸基因缺失突变体在治疗和调节免疫反应疾病方面也具有较大的作用，但也有相关文献报道益生菌磷壁酸有一定的抗炎作用可作为免疫佐剂，这与前面的论述相悖。因此需要逐步深入了解益生菌的作用模式，重点研究其细胞表面性质的特异性，探讨益生菌磷壁酸的免疫反应作用机制以及在分子和细胞学领域运用体内和体外实验相结合进行更深入的探索。