基于Wnt/β-catenin信号通路探讨太白楤木抗去卵巢大鼠骨质疏松症的作用和机制

潘亚磊 张玉苗 杨易宁 李引刚 刘艳平*

1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046 2.陕西中药资源产业化省部共建协同创新中心/秦药特色资源研究开发国家重点实验室(培育)/陕西省创新药物研究中心，陕西 咸阳 712083 3.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000

绝经后骨质疏松症是指妇女绝经后由于卵巢功能迅速衰退，体内雌激素水平明显下降，导致骨量降低为主要特征的一种全身代谢性疾病。目前治疗绝经后骨质疏松症的药物有膦酸盐类、生长激素类、氟化物等，这些药物虽然可调节骨代谢，但在疗效和不良反应上仍然有待改进[1-2]。

中医将骨质疏松症归为“骨痿”“骨枯”等范畴，认为绝经后骨质疏松症的发病与肝、脾、肾关系最为密切，对于其治疗大多从补肾健脾益肝方面进行辨证施治[3]。太白楤木Aralia taibaiensis，又名飞天蜈蚣七，为楤木属 Aralia Linn.的多年生植物太白楤木的干燥根茎。《本草拾遗》中记载太白楤木性温，味微咸，归肝、心、肾三经，具有补肝肾，壮筋骨，祛风湿，利小便，散瘀血，消肿毒之功效[4]。研究表明，太白楤木主要含有皂苷类、黄酮类、多糖类、挥发油类和微量元素等活性成分，具有降血糖、降血脂、抗衰老、抗菌、抗病毒以及抗肿瘤等药理作用[5-6]。在骨科临床实践中，著名草医徐家成将太白楤木鲜根皮捣烂敷于局部，可促进患者骨折愈合[7]；全国名老中医李彦民教授将太白楤木作为治疗骨质疏松症的主药，具有良好疗效[8]。前期研究发现太白楤木提取物可保护成骨细胞的活力、促进增殖、成骨分化和矿化[9]。为了系统考察太白楤木对骨质疏松症的作用，本研究采用去卵巢大鼠构建骨质疏松症模型，探讨太白楤木防治骨质疏松症的作用和机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

3月龄未经产SPF级SD雌性大鼠40只，体重(260±15) g，购自成都达硕实验动物有限公司[生产许可证号SCXK(川)2020 -030]。大鼠饲养于陕西中医药大学陕西中药资源产业化省部共建协同创新中心SPF 级动物饲养室[SYXK(陕)2017-004]，室温22 ℃～26 ℃，相对湿度30%～70%，自由进食饮水，12 h 间隔照明。

1.2 药物、试剂与器材

太白楤木(产地陕西太白县)购自宝鸡市科兴药业有限公司，经陕西中医药大学王继涛教授鉴定为五加科楤木属植物太白楤木 Aralia taibaiensis的干燥根皮；仙灵骨葆胶囊(批号2101002，贵州同济堂制药有限公司)。

骨碱性磷酸酶(BALP)、Ⅰ型胶原交联氨基端肽(NTX-Ⅰ)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)ELISA检测试剂盒(批号：ml003415、ml028329和ml059485，上海酶联生物科技有限公司)；戊巴比妥钠(批号：20191011，美国Sigma公司)；青霉素钠(批号：20120603，哈药集团)；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(批号：BA-4022，海珠贝索生物技术有限公司)；骨蛋白提取试剂盒(批号：20201225，上海贝博生物科技有限公司)；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGA凝胶制备试剂盒(批号分别为 PC0020、P1200，北京索莱宝科技有限公司)；抗体Wnt3a(2721 T)、β-catenin(8480 T)、p-β-catenin(2009)、RUNX2(12556 S)、β-actin(3700)、兔二抗(7074)均购自美国Cell Signaling Technology公司。

骨结构分析仪(eXplore Locus，美国GE公司)；Mini BionixⅡ材料试验机(MTS 858，美国MTS公司)；倒置荧光显微镜(IX73-DP73，日本Olympus公司)；全波长酶标仪(Multiskan GO，美国Thermo公司)；高速冷冻离心机(5910R，德国Eppendorf公司)；电泳仪(PAC300，美国Bio-Rad公司)；化学发光分析仪(XRS+，美国Bio-Rad公司)。

1.3 太白楤木提取液的制备

取太白楤木1 kg，加入12 L体积水浸泡6 h后，煎煮2次，每次60 min，过滤后合并提取液，用旋转蒸发仪浓缩至1 L，即含生药量1 g/mL，保存于4 ℃冰箱备用。

1.4 造模、分组及给药

大鼠适应性喂养1周后，随机分为假手术组、模型组、仙灵骨葆胶囊组(0.3 g/kg)、太白楤木低剂量组(0.4 g/kg)和太白楤木高剂量组(0.8 g/kg)，每组8只。假手术组在卵巢周围切除少量脂肪，其余组行双侧卵巢摘除术，术后连续3 d青霉素肌注。仙灵骨葆胶囊、太白楤木低剂量和太白楤木高剂量分别用蒸馏水配置成质量浓度为0.03 g/mL、0.04 g/mL和0.08 g/mL的溶液。术后一周各组灌胃给予相应药物，灌胃体积10 mL/kg，假手术组和模型组给予等量蒸馏水，1次/d，连续12周。

1.5 样本的收集与测定

给药结束后，大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，经腹主动脉采血。冰上静置30 min后，4 ℃下2 000 r/min离心20 min，取上清-80 ℃保存备用。取大鼠左右侧的股骨、胫骨，剔除附着的肌肉及结缔组织。左胫骨置于4%福尔马林；右胫骨于-80 ℃的冰箱中保存；左股骨用浸泡过生理盐水的纱布包裹，于-80 ℃的冰箱中保存备用；右股骨用75%的乙醇固定保存备用。

1.6 生物力学性能测定

左股骨室温复温后，将样本放置在材料力学测试机两个支撑的横杆上，支点距离为20 mm，于股骨中段施加载荷速度2 mm/min，直至股骨断裂，游标卡尺测定中段内外长短径，软件记录参数值。

1.7 Micro-CT分析

采用micro-CT扫描大鼠右股骨远端形态结构，分辨率为20 μm。采用软件对感兴趣区域的骨密度、骨组织比例、骨小梁数量及骨小梁连接密度进行分析。所有标本的分析范围保持一致。

1.8 ELISA法检测血清骨代谢指标

血清样本解冻后混匀，按照试剂盒说明书采用ELISA检测试剂盒检测血清中骨碱性磷酸酶(BALP)、Ⅰ型胶原交联氨基端肽(NTX-Ⅰ)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)含量。

1.9 苏木素-伊红染色

各组大鼠胫骨固定2周，经脱钙、包埋、切片后，进行苏木素-伊红染色。再经脱水、透明、封片后，于显微镜下观察骨组织形态及骨丢失情况。

1.10 Western blot检测

将胫骨切开，液氮中将其研磨粉碎成粉末，加入细胞裂解液。蛋白定量后，变性上样，凝胶电泳，转膜后封闭 2 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，更换二抗，室温孵育 2 h。化学发光显色、分析。

1.11 统计学处理

数据采用均数±标准差表示，采用 SPSS 20.0 软件进行分析，组间比较采用单因素方差齐性分析，若方差齐，组间比较采用 LSDt检验；若方差不齐，组间比较采用 Dunnett’st检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠股骨生物力学变化

股骨三点弯曲试验表明，假手术组的最大载荷、刚度和最大应力均高于模型组，两组间比较差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，仙灵骨葆胶囊组和太白楤木高剂量组最大载荷、刚度和最大应力均显著提高(P<0.01)，见表1。

表1 各组大鼠左侧股骨三点弯曲试验结果Table 1 Three-point bending test results of the left femur of rats in each group

2.2 大鼠股骨骨密度和微结构变化

各组大鼠股骨远端微结构见图1，骨密度和骨小梁参数见表2。与假手术组相比，模型组骨密度、骨组织比例、骨小梁数量和骨小梁厚度显著下降，骨小梁分离度显著增大(P<0.01)；与模型组相比，仙灵骨葆胶囊组和太白楤木高剂量组可提高骨密度、骨组织比例、骨小梁数量和骨小梁厚度，减小骨小梁分离度，差异具有统计学意义(P<0.01)。

图1 各组大鼠股骨影像学变化Fig.1 Micro-CT imaging of the distal femurs of rats in each group

表2 各组大鼠股骨骨密度和微结构参数Table 2 Bone mineral density and microstructure parameters of the distal femurs of rats in each group

2.3 大鼠骨代谢相关生化指标

与假手术组相比，模型组血清BALP水平显著降低，NTX-Ⅰ和TRAP水平则显著升高(P<0.01)；与模型组相比，仙灵骨葆胶囊组和太白楤木高剂量组可显著提高BALP水平(P<0.01)，仙灵骨葆胶囊组、太白楤木低剂量组和太白楤木高剂量组显著降低NTX-Ⅰ和TRAP水平，见表3。

表3 各组大鼠血清骨代谢指标Table 3 Serum bone metabolism markers of rats in each group

2.4 大鼠骨组织形态学观察

胫骨近端骨小梁组织切片如图2所示，假手术组大鼠骨小梁致密，骨小梁网状结构正常；模型组大鼠骨小梁疏松变薄，导致骨小梁间隙变宽；仙灵骨葆胶囊组骨小梁接近假手术组；太白楤木低剂量组和太白楤木高剂量组大鼠的骨小梁数量和连接增加明显。

图2 大鼠骨组织形态学观察(HE，×40)Fig.2 Bone histomorphometry of rats (HE, ×40)

2.5 大鼠骨组织相关蛋白表达水平及磷酸化对比

模型组Wnt3a、β-catenin和RUNX2蛋白表达水平均低于假手术组，p-β-catenin蛋白水平则高于假手术组，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，仙灵骨葆胶囊组和太白楤木高剂量组可提高Wnt3a、β-catenin和RUNX2蛋白表达，降低p-β-catenin蛋白水平，差异具有统计学意义(P<0.01)。见图3、表4。

图3 Western blot检测结果Fig.3 Results of Western blotting注：1：假手术组；2：模型组；3：仙灵骨葆胶囊组；4：太白楤木低剂量组；5：太白楤木高剂量组

表4 各组大鼠骨组织相关蛋白表达及磷酸化水平Table 4 Expressions and phosphorylation levels of bone-related proteins in rats in each group

3 讨论

骨质疏松症患者初期症状不明显，致使就诊率低，老年人多以骨质疏松性骨折为首发症状和就诊原因，因此防治骨质疏松性骨折发生也成为治疗骨质疏松症的重要目标[10]。三点弯曲试验是测定骨折过程中骨所能承受力学参数的常用试验。本研究采用三点弯曲试验对各组大鼠股骨骨折时的生物力学性能进行测定，结果显示太白楤木可在一定程度上逆转因去卵巢导致的大鼠骨生物力学性能下降。此外，骨质疏松症患者骨质减少往往导致骨小梁微结构的损伤，也会造成易发生骨折[11]。本研究显示，太白楤木可在一定程度上提高去卵巢大鼠骨密度，保护骨小梁微结构不被破坏。

骨形成和骨吸收的偶联是骨代谢的基本过程，当长期骨吸收的速率大于骨形成时便引发骨质疏松症。血清BALP可以反映成骨细胞活性，Song等[12]研究发现妇女绝经后血清BALP 水平降低。血清胶原降解标志物NTX-Ⅰ和破骨细胞分泌的TRAP水平则反映了骨吸收的速率[13]。大鼠去卵巢后骨吸收增强，成骨活性减弱，对照药仙灵骨葆胶囊可提高去卵巢大鼠骨形成标志物，降低骨吸收标志物，与任世元等[14]研究结果一致。本研究骨代谢指标结果显示，太白楤木可在一定程度上调节骨代谢。

Wnt/β-catenin信号通路不仅可通过成骨细胞调控骨形成，还能负向调控破骨细胞的分化来维持骨稳态，在骨质疏松症的发生中具有重要作用[15]。Wnt3a可调控骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，提高成骨细胞ALP 的活性和加强骨保护素的表达，最终促进成骨[16]。前期体外研究表明，太白楤木提取物可通过调节Wnt/β-catenin信号通路，进而提高大鼠成骨细胞的活力、增殖、分化和矿化[9]。本研究进一步在体内水平发现，太白楤木提取物可激活Wnt/β-catenin信号通路，进而促进下游成骨特异性蛋白RUNX2的表达。RUNX2的高表达可促进成骨细胞合成骨基质[17]。太白楤木对Wnt/β-catenin信号通路的调节作用可能是其防治去卵巢大鼠骨质疏松症的机制。

综上所述，太白楤木可以明显改善去卵巢诱导的大鼠骨质疏松症，其可能是通过调节Wnt/β-catenin信号通路来实现的。