早期宫颈癌(Ⅰa1～Ⅱa2)术后TLR4、HMGB1和RAGE水平对24个月肿瘤复发的预测价值

蔡玉茹 郭婧 杨红玉 李楠 孙亚楠

宫颈癌是妇科第二大恶性肿瘤，是发展中国家女性癌症死亡的主要原因，每年约30万女性死于该病，且近年来发病率呈现年轻化的趋势[1,2]。随着女性保健意识的提高及早期筛查手段的普及，早期宫颈癌确诊比例逐年上升。早期宫颈癌患者宫旁浸润(parametrial involvement，PI)的发生率较低，以宫颈锥切术和宫颈根治术为主的综合治疗是主要针对性治疗方案，其具有创伤小、恢复快且并发症相对较少等优点[3]，但术后复发仍就对患者生存率和生存质量产生重大影响。本次研究基于“肿瘤局部免疫状态对其进展、侵袭转移及预后均有着一定的预测诊断价值”的理论，共纳入血清、肿瘤组织功能性蛋白三类，高迁移率族蛋白B1(high mobility group box ehromosomal-protein-1，HMGB1)属于非组蛋白染色体结合蛋白，位于核小体内；现已被证实具有一定的警报素功能，即由坏死、损伤细胞释放入细胞外，可起到内源性的危险信号活化天然免疫细胞的作用[4]。HMGB1被释放入细胞外以后，对树突状细胞(dendritic cells,DC)具有一定的募集与活化作用，募集作用主要依靠晚期糖基化终末产物特异性受体(receptor for advanced glycation endproducts,RAGE)，活化作用则依赖toll样受体4(toll-like receptor-4,TLR4)介导，进而激活NF-kB通路、PI3K/AKT通路等多种途径。本次研究由肿瘤组织及术后血清中功能性蛋白HMGB1、RAGE和TLR4水平出发，前瞻性评估研究指标对早期宫颈癌宫颈锥切术后24个月肿瘤复发的量化预测价值，分析其影响因素，为精准干预提供更多的依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 分析2016年3月至2019年6月于石家庄市人民医院确诊的早期宫颈癌患者175例，年龄26～56岁，平均年龄(49.26±5.75)岁；孕产数0～5胎；其中腺癌47例，鳞癌128例；样本术后病理FIGO分期为Ⅰa期112例(Ⅰa1期33例，Ⅰa2期89例)，Ⅰb期35例(Ⅰb1期18例，Ⅰb1期8例，Ⅰb2期9例)，Ⅱa期28例(Ⅱa1期19例，Ⅱa2期9例)；行宫颈锥切术85例(其中3例术前病理CIN3患者术后确诊为Ⅰb1期，追加广泛全子宫+盆腔淋巴结切除术)，腹腔镜辅助宫颈根治术90例。随访期限24月，随访截止期为2021年6月。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①样本均符合国际妇产科联盟(FIGO)宫颈癌临床分期及诊断相关标准(2018)[5]；②病理确诊为鳞癌、腺癌；③FIGO分期为1期④研究对象知情同意，自愿参加。

1.2.2 排除标准：①伴有其他重大器官、系统疾病的样本；②合并宫腔疾病(宫腔或宫旁占位等)可能对本次研究结果造成影响的样本；③排除鳞癌、腺癌、腺鳞癌以外的特殊病理类型；④凝血功能障碍；⑤非知情同意，依从性较差随访困难的样本。

1.3 方法

1.3.1 宫颈锥切术：①常规消毒铺巾，患者截石位充分暴露宫颈；②患者全身麻醉；③阴道镜探查确定病变范围；选择合适规格的环形电刀(50 W)；④环形电极由内向外顺时针切除病变组织，切除范围>病变范围5 mm；⑤电极移动均匀缓慢，残端宫颈进行1 cm预防性解除，球形电极电凝止血。

1.3.2 根治性宫颈切除术：①常规消毒铺巾，插管全身麻醉，患者取截石位；②人工气腹形成及穿刺管置入；③探查子宫与周围组织毗邻情况；连续切断双侧卵巢盆腔漏斗韧带(结扎法)；④盆腔淋巴清扫；⑤子宫切口，膀胱反折、下推至宫颈外口下3 cm；⑤钝性分离宫旁结缔组织；⑥游离子宫动脉，结扎下行支；⑦依次打开膀胱、宫颈韧带等，直至切开阴道壁并切下宫颈(宫颈外口下2 cm处)；⑧术中冰冻活检病理阴性患者，可于缝合前置入T型宫内节育器，阴道残端缝合。

1.4 观察指标 辅助检查资料包括术后血清及肿瘤组织中HMGB1、RAGE和TLR4水平，临床、病理资料包括：肿瘤类型、肿瘤大小、切缘情况、间质浸润情况、淋巴转移情况、FIGO分期。删失数据(censoring data)生存分析研究结束期，样本发生研究之外的其他事件或生存结局，因此无法对研究结局事件进行观察与记录。删失原因包括失访、研究对象不配合或研究对象出现研究以外因素的死亡等。诊断临界值为曲线中约登指数最大的界点，约登指数=(灵敏度+特异度-1)。

1.4.1 仪器与试剂

1.4.1.1 仪器：①酶联免疫分析仪(JD-SY96A，山东竞道光电科技有限公司)；②光学显微镜(CX23，奥林巴斯)；③旋转石蜡切片机(CUT4062，德国SLEE)；④病理石蜡包埋冷台机(LS-101，上海寰熙医疗器械有限公司)⑤电热恒温干燥箱(昆山海达精密仪器有限公司)等。

1.4.1.2 试剂：一抗兔抗人HMGB1、RAGE和TLR4多克隆抗体(美国 Abcam 公司)，辣根过氧化物酶、苏木紫染色剂、乙醇、柠檬酸缓冲液等。

1.4.2 肿瘤组织HMGB1、RAGE和TLR4水平检测：①标本由4%甲醛液固定，常规脱水、石蜡包埋、12点连续切片(厚度4 μm)；②按步骤及要求时限进行相应的脱蜡、浸洗、PBS清洗以及孵育过程，最终染色封片；③上光学显微镜，每张切片随机选取15个视野取均值。④结果判定：按照染色强度及细胞阳性率，对结果进行0～6评分。阳性细胞构成比<10%、10%～40%、40%～70%以及>70%赋值0、1、2和3分；染色强度以“无染色”、“高倍镜下阳性而低倍镜下阴性”、“低倍镜下阳性”和“低倍镜下强阳”性依次赋值0、1、2和3分。以15个视野两项评分乘积均值作为最终评估依据，<3分、4～5分、6～8分和9分依次判定为不表达、低表达、中表达和高表达[6,7]。

1.4.3 血清HMGB1、RAGE和TLR4水平检测：取术后第2天晨起空腹静脉血4 ml，肝素抗凝，3 000 r/min离心10 min；取上清如低温冰箱保存(-80℃)，避免样本反复冻融。上酶联免疫分析仪以酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测样本术后血清中TLR4、HMGB1和RAGE水平。

1.4.4 随访：12个月随访期限内每3个月行相关复查；连续复查4次皆为阴性的患者可改为6个月复查1次，随访截止期为2021年6月。

2 结果

2.1 2组术后血清HMGB1、RAGE和TLR4 水平比较 24个月随访时限结束，得到复发样本37例，非复发样本134例(失访4例)，术后样本血清HMGB1水平为正态性计量资料(Kolmogorov-SmirnovZ=0.761,P=0.609)、RAGE(Kolmogorov-SmirnovZ=0.904,P=0.387)和TLR4(Kolmogorov-SmirnovZ=1.371,P=0.047) 水平为非正态性计量资料，以复发情况进行分组，组间术后血清功能性蛋白水平比较，得到HMGB1、RAGE和TLR4 水平差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组术后血清HMGB1、RAGE和TLR4 水平比较 n=114

2.2 ROC曲线分析

2.2.1 血清HMGB1、RAGE和TLR4曲线下面积分别为0.813、0.802和0.865，预测诊断临界值分别为0.822、0.751和0.861。见表2，图1。

表2 术后血清多种功能蛋白水平对宫颈癌术后24个月复发情况量化性预测价值的ROC曲线分析

图1 术后血清HMGB1、RAGE和TLR4 水平对24个月期宫颈癌复发的量化预测诊断价值

2.2.2 进一步计算预测诊断临界值，血清HMGB1、RAGE和TLR4诊断临界值分别为0.73 ng/ml、188 pg/ml和24.88 pg/ml。其中血清RAGE诊断临界值的特异度偏低(49.50)。见表3。

表3 血清HMGB1、RAGE和TLR4诊断临界值

2.2.3 因曲线个别部位存在交叉，进一步两两比较得到，血清RAGE和TLR4的ROC曲线诊断价值存在差异(P<0.05)。见表4。

表4 血清HMGB1、RAGE和TLR4曲线诊断价值比较

2.3 生存分析

2.3.1 结合前瞻性随访复查评估肿瘤组织功能性蛋白表达对早期宫颈癌(Ⅰa1～Ⅱa2)术后“非复发状态”时间分布的拟合能力：按照术后组织相关研究功能蛋白细胞表达水平，将样本分成2组，无表达与低表达样本合并组成“阴性组”，中表达与高表达样本合并组成“阳性组”。见表5。

表5 样本研究时限内宫颈癌复发、删失率 n=175，例(%)

2.3.2 Kaplan-Meier生存分析法评估体重控制对妊娠期糖尿病干预效果的分析：Kaplan-Meier生存分析，以Log Rank test得到，以不同组织功能性蛋白分组后，阴性组“非复发状态”持续的时间均长于阳性组，差异有统计学意义(P<0.05)。由于样本宫颈癌复发率低于50%，故研究结果不涉及生存表中位数分析。见表6，图2～4。

表6 Kaplan-Meier生存分析法评估体重控制对妊娠期糖尿病干预效果的分析

图2 Kaplan-Meier生存分析法评估肿瘤组织HMGB1水平对宫颈癌复发的时间分布拟合效能 图3 Kaplan-Meier生存分析法评估肿瘤组织RAGE水平对宫颈癌复发的时间分布拟合效能 图4 Kaplan-Meier生存分析法评估肿瘤组织TLR4水平对宫颈癌复发的时间分布拟合效能

2.4 早期宫颈癌术后复发的多因素Cox风险比例回归模型分析

2.4.1 模型变量赋值：根据单因素KM分析结果，将上述3种组织功能性蛋白均带入多因素COX分析中，参考相关文献[8,9]，另外加入肿瘤类型、肿瘤大小、FIGO分期、淋巴结转移和深层间质浸润、切缘状态6项，共9项协变量进入 Cox风险比例回归模型。见表7、8。

表7 COX风险比例模型因素分类变量赋值(1)

表8 COX风险比例模型因素赋值(2)

2.4.2 Cox风险比例回归模型分析：协变量分别为TLR4、术后FIGO病理分期、切缘状态、淋巴转移以及深层间质浸润，偏回归系数(β)分别为1.812、2.982、1.963、1.919、1.209。见表9，图5。

表9 早期宫颈癌术后复发的多因素Cox风险比例回归模型分析

图5 协变量均值处的“非复发”生存函数

3 讨论

HMGB1作为重要的晚期炎性因子，对炎症的维持与放大具有重要作用[10-13]。RAGE属于多配体的跨膜信号转导受体，相关研究显示，其与炎性反应、肿瘤侵袭力、神经血管再生等均存在关联[14,15]。TLR4属于TLRs家族跨膜非催化性蛋白质，参与非特异性免疫，于髓源性细胞上表达，可识别革兰氏阴性菌脂多糖(LPS)、宿主坏死细胞释放产生的休克蛋白等，还可被局部内源性酶级联活化反应等激活[16]。TLR4过表达，可激活形成TLR4-MD2-LPS二聚体复合物，启动相关的促炎性细胞因子、趋化因子和miRNA的下游信号途径。因此，越来越多的研究显示，TLR4的炎性表达，对调节肿瘤周围的炎性环境和肿瘤进展有着不可忽视的作用[17,18]。本次研究选取宫颈癌早期(Ⅰa1～Ⅱa2)患者为研究样本，样本均行宫颈锥切术或根治术治疗，以血清及肿瘤组织中HMGB1、RAGE和TLR4为主要评估指标；根据以往文献研究结果得到，宫颈癌高复发期为1～2年[19]，故本次研究跟踪随访期定为24个月。ROC曲线分析结果显示，术后血清中HMGB和TLR4对24个月期宫颈癌复发具有一定的量化预测诊断价值，曲线下面积分别达到0.824和0.860；RAGE的ROC曲线较TLR4诊断价值偏低。血清HMGB和TLR4诊断临界值分别为0.73 ng/ml和24.88 pg/ml，且灵敏度、特异度均达到70%以上，其中TLR4诊断临界值灵敏度为86.49%，对早期筛查意义较高；而RAGE诊断临界值为188 pg/ml，灵敏度为91.89%，虽然特异度仅为49.50%，但对于早期筛查对于敏感性的较高要求，其血清水平仍旧具有一定的意义。可结合相应的预测诊断临界值，进行早期重点干预。

Cox风险比例回归模型属于半参数回归模型，用以描述不随时间变化的多个因素对某一时间某事件发生率的影响[20]。本次研究将肿瘤组织HMGB1、RAGE和TLR4的表达水平连同其他热点研究因素共9项，作为协变量进入Cox风险比例回归模型进行分析，结合时间因素，得到影响宫颈癌复发的协变量分别为TLR4、术后FIGO病理分期、切缘状态、淋巴转移以及深层间质浸润。HMGB1和RAGE由于与TLR4激活炎性反应通路作用上具有交互性，在多因素分析中并没有表现出差异有统计学意义；另外FIGO病理分期较高、切缘阳性、存在淋巴转移及深层间质浸润的患者，其复发风险更高。

因此可得，早期宫颈癌(Ⅰa1～Ⅱa2)患者术后血清及肿瘤组织中HMGB1、RAGE和TLR4水平对肿瘤复发、复发时限等均具有一定的定性及定量诊断价值，可结合临床、病理表现，对高风险样本进行重点检测干预；对宫颈癌宫颈锥切术及根治术术后判断预后，具有一定的意义。