山香圆叶挥发油化学成分及抗氧化和抗炎活性研究

刘 昭，李 利，汤杨黔南，林丽美，夏伯候*

1湖南中医药大学，长沙 410208；2湖南省中医药研究院，长沙 410013

山香圆叶(别名两指剑、千打锤、七寸钉)为省沽油科植物山香圆(TurpiniaargutaSeem)的干燥叶[1]。其主要分布于我国的江西、福建、湖南、广东、海南、广西、四川、贵州等地。山香圆叶性味苦，寒；归肺、肝经，具有清热解毒、利咽消肿、活血止痛的功效，对于咽喉、扁桃体、上呼吸道等炎症或脓肿性疾病具有快速、高效的作用[2,3]。目前，山香圆叶的药理研究主要集中在抗炎、抗菌、抗氧化、镇痛以及增强免疫等方面。基于以上活性，从山香圆叶中发现了100个以上的化学成分，包括黄酮、三萜、酚酸、大柱烷、鞣质、生物碱等多种中等极性以上的物质[4,5]，其中，黄酮是研究最为广泛的成分，也是药理活性最多的成分，然而，较少的研究探讨其中小极性物质(如精油)的活性及化学成分，限制了对其进一步的开发和应用。因此，探明山香圆叶中小极性物质的化学成分及可能的生物活性，对于其深入的药用价值的开发具有较好的参考意义。

挥发油又称精油，大部分具有香气，如薄荷油、丁香油等，其在医药领域具有重要作用，其可治疗例如前列腺癌[6]、乳腺癌[7,8]、肺癌[9]等癌症，并且具有作为抑菌剂、抗氧化剂、抗病毒药物和皮肤渗透增强剂的潜能。因挥发油的获取方式相对其他中大极性物质而言具有提取简单，提取过程环保等优点，其具有更大的开发前景和药用价值。

因此，本研究首先应用超临界萃取法提取山香圆叶挥发油等中小极性物质；再分别用GC-MS法和LC-MS法全面表征其小极性挥发性物质和中等极性物质，并鉴定其结构。最后，通过基于体外的抗氧化和细胞抗炎实验，探讨其可能的生物活性，旨在挖掘山香圆叶更广泛的药用价值，同时为资源的合理利用提供新思路和新方向。

1 材料与方法

多功能粉碎机(浙江江景天工贸有限公司);SQF电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司);超临界流体CO2萃取装置(杭州华赛泵业有限公司);单四级杆气质联用色谱仪(GCMS-QP2020，岛津);超高效液相色谱(1290UPHLC，Agilent);高分辨质谱(Q Exactive Foucus，Thermo Fisher Scientific);多功能酶标仪(Multiskan MK3，Thermo公司);CO2培养箱(SHEL-LAB，Sheldon Manufactring inc)。

山香圆叶购自湖南省长沙市高桥药材市场，经湖南中医药大学龚力民副教授鉴定为省沽油科植物山香圆(TurpiniaargutaSeem)的干燥叶[1]；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，Sigma公司，批号：10207 0402)；Vc(Sigma-Aldrich公司，批号：101911771)；ABTS法总抗氧化能力检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司，批号：070319191112)；小鼠巨噬细胞RAW 264.7(中国科学院上海细胞库)；MTT(Sigma公司，批号：1003010349)；DMEM高糖培养基(美国Hyclone，批号：SH30022.01B)；胎牛血清(美国Hyclone，批号：27250-018)；LPS(Sigma公司，批号：12171104)；阳性药物地塞米松(DXMS，北京索莱宝科技有限公司，批号：D8040)；小鼠IL-6 ELISA试剂盒(武汉贝茵莱生物科技有限公司，批号：MU30044)；NO Griess试剂盒(碧云天生物技术研究所，批号：202003)。

1.1 挥发油的提取

山香圆叶药材在50 ℃下烘干后打粉，过60目筛，取629 g山香圆叶药粉置于萃取釜中。具体操作条件为：萃取釜压力为25 MPa(温度45 ℃)；分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ压力均为5 MPa；温度分别为50 ℃、55 ℃，CO2流量为24 L/h；萃取时间为3 h。提取完成后于6 000 r/min，4 ℃条件下离心5 min，即得到山香圆叶的挥发油成分。

1.2 GC-MS分析

GC-MS条件：色谱柱为Rtx-5 MS(30 m×250 μm，0.25 μm)，进样口温度条件为270 ℃，分流比为20∶1，载气为He(76 mL/min)压力为57.4 kPa，程序升温条件为：初始温度为120 ℃，保留2 min；以15 ℃/min的速度升温至180 ℃后再以10 ℃/min升至220 ℃，保持1 min；以2 ℃/min升至224 ℃；以1 ℃/min升至232 ℃；以2 ℃/min升至240 ℃，保持1 min后再以3 ℃/min速度升至243 ℃；以1 ℃/min升至249 ℃；以3 ℃/min升至288 ℃；最后以1 ℃/min升至300 ℃，保持10 min。EI离子源，离子源温度为200 ℃，接口温度为280 ℃，溶剂延迟时间5 min，扫描宽度为0～0.2 kV。

甲酯化前处理：称取200 mg山香圆叶挥发油加入2 mL 2 mol/L的KOH-CH3OH溶液，再加入10 mL正庚烷，在涡旋震荡仪中混匀后静置分层。取上清液过2.2 μm的微孔滤膜后再装入进样瓶中以备GC-MS检测。

甲酯化GC-MS条件：气相色谱柱为Rtx-5 MS(30 m×250 μm，0.25 μm)，进样口温度条件为270 ℃，分流比为40∶1，载气为He(76 mL/min)，柱流速为0.83 mL/min，平均线为33.9 cm/sec。程序升温条件为：初始温度为100 ℃，保留2 min后以10 ℃/min的速度升温至205 ℃后再以3 ℃/min升至227 ℃，然后再以5 ℃/min升温至265 ℃，最后以3 ℃/min升至300 ℃保持10 min。EI离子源，离子源温度为200 ℃，接口温度为280 ℃，溶剂延迟时间5 min，扫描宽度为0～0.2 kV。

1.3 LC-MS分析

LC-MS分析条件：色谱柱为BEH C18色谱柱(1.7 μm×2.1×100 mm)；流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)，采用多步线性梯度洗脱：0～3.5 min，95%→85% A；3.5～6 min，85%→70% A；6～6.5 min，70% A；6.5～12 min，70%→30% A；12～12.5 min，30% A；12.5～18 min，30%→0% A；18～25 min，0% A；25～26 min，0%→95% A；26～30 min，95% A。进样体积为5 μL；毛细管温度：400 ℃；扫描质量范围为m/z100～1 500；鞘气流速：45 Arb，辅助气流速：15 Ar；Full ms分辨率：70 000，MS/MS分辨率：17 500；碰撞能量：15/30/45 V；喷涂电压：4.0 kV(正)或-3.6 kV(负)。

通过FullScan-ddMS2功能进行一级、二级质谱数据采集。将获得的质谱原始数据基于自建数据库MWDB(Metware Database)及代谢物信息公共数据库对物质进行筛选和鉴定。所有化合物的二级MS匹配率均在80%以上。

1.4 山香圆叶挥发油的抗氧化活性检测

在药物的体外抗氧化实验中，常用DPPH法进行中药提取物抗氧化能力的检测[10]，用ABTS法进行植物源单体和粗体物的总抗氧化能力的检测[11]。

准确称取山香圆叶挥发油100.00 mg样品置于10 mL容量瓶中，用DMSO溶液定容至刻度线得到浓度为10 mg/mL的样品溶液，再将其分别稀释到6、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL。

准确称取5 mg的DPPH试剂置于50 mL容量瓶中用DMSO定容至刻度线，将其混匀，在避光处保存。按照试剂盒说明书操作规程分别测定不同浓度样品的清除DPPH和ABTS能力。

1.5 抗炎活性测定

将培养有小鼠腹腔巨噬细胞株RAW 264.7的高糖DMEM培养基(含10%胎牛血清)，置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。利用MTT法测定药物对RAW 264.7细胞活性影响，将培养的细胞分为空白对照组；模型组(加入终浓度为1 μg/mL的LPS)；DMSO组(0.2%)；DXMS组(50 μg/mL)；山香圆叶低、中、高剂量组(浓度分别为30、40、50 μg/mL)。同时，检测其对LPS诱导的RAW 264.7细胞的毒性。山香圆叶组各孔加入含有不同浓度(0、20、40、60、80、100、120、160 μg/mL)山香圆叶提取物完全培养液100 μL，孵育2 h后加入LPS使得终浓度为1 μg/mL，空白组与溶剂组加入等体积溶剂。药物每个浓度设4个复孔，细胞培养24 h后，吸弃原培养基，每孔加入100 μL的MTT(0.5 mg/mL)，继续培养4 h，弃培养液，加入DMSO 0.15 mL，震荡、混匀10 min后于酶标仪490 nm波长下测吸光度，采用MTT检测不同浓度药物对细胞存活率的影响。

炎症因子IL-6、NO含量检测：用Griess法和ELISA检测山香圆叶挥发油对LPS诱导的RAW 264.7细胞上清液中NO和IL-6含量的影响，取小鼠RAW 264.7巨噬细胞接种于48孔培养板中，细胞密度为2×104个/mL，每孔200 μL，温度37 ℃，5% CO2条件下培养过夜后，弃培养液，加入无血清DMEM培养基同步化24 h，山香圆叶低、中、高剂量完全培养液每孔200 μL，设置4个复孔；孵育2 h后加入200 μL的LPS使得终浓度为1 μg/mL，空白组加入等体积无血清的DMEM，阳性药物组加入50 μg/mL的DXMS，孵育24 h后收集各孔上清液在3 000 r/min条件下离心10 min，吸取上清液，用于炎症因子的检测。

1.6 数据分析

数据均用“平均值±标准偏差”表示，采用GraphPad Prism 8.0进行绘图，并用SPSS 21.0软件进行统计分析，P<0.05表示有显著差异，P<0.01表示有极显著差异。

2 结果

2.1 挥发油的提取结果

采用SFE-CO2法提取得到棕黄色的山香圆叶挥发油，气味清香。将其称重为10.566 g，按公式：提取率=提取物质量/样品总质量×100%，计算得其提取率为1.68%。

2.2 山香圆叶挥发油成分分析

2.2.1 GC-MS分析结果

山香圆叶挥发油直接进样的GC-MS总离子流图见图1a，主要鉴定得到38个化学成分，包括(-)-α-蒎烯、棕榈酸、棕榈酸乙酯等(见表1)，按照峰面积归一化法计算各成分的相对百分含量，可得其中占比较大的为亚油酸、γ-谷甾醇、角鲨烯、2,2′-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)，分别占15.09%、7.68%、7.35%和5.6%。甲酯化处理后的GC-MS分析共鉴定得到42个化合物(见表2)，主要包括月桂酸、棕榈酸、硬脂酸等，按照峰面积归一化法计算各成分的相对百分含量，可得其中占比较大的为反-9-十八碳烯酸、亚油酸、棕榈酸，分别占34.56%、10.08%和8.53%。

续表1(Continued Tab.1)

表2 山香圆叶挥发油甲酯化后的GC-MS成分分析

续表2(Continued Tab.2)

2.2.2 LC-MS分析结果

超临界提取的油中除了挥发性的物质以外，还包含了中等极性物质。作为GC-MS的补充，LC-MS可有效地检测这些物质。从LC-MS正负离子模式下的离子流图可得(见图2)，油中存在大量的中等极性物质，通过数据库二级匹配，正离子模式下共鉴定出168个物质(见表3)，负离子模式下共鉴定出106个物质(见表4)。

表3 LC-MS正离子模式成分分析

续表3(Continued Tab.3)

续表3(Continued Tab.3)

续表3(Continued Tab.3)

续表3(Continued Tab.3)

表4 LC-MS负离子模式成分分析表

续表4(Continued Tab.4)

续表4(Continued Tab.4)

续表4(Continued Tab.4)

图2 山香圆叶挥发油LC-MS正(a)、负(b)离子模式流图

经人工校对，去除18个重复的化合物，最终共鉴定出256个化合物，主要为萜类、苯丙素类、酚类、黄酮类、生物碱类、香豆素及其衍生物类、脂肪酰类、倍半萜类、脂肪酸类。

2.3 山香圆叶中挥发油的抗氧化活性

山香圆叶挥发油的抗氧化活性采用IC50表示，山香圆叶挥发油对DPPH自由基的IC50为3.56 mg/mL，在相同浓度范围内山香圆叶挥发油对ABTS自由基的抑制率则不足50%，因此，山香圆叶挥发油对DPPH的清除能力强于ABTS自由基，但对两种自由基的清除能力均与浓度成正相关(见图3、图4)。

图3 山香圆叶挥发油对DPPH自由基的清除能力(n = 3)

图4 山香圆叶挥发油对ABTS自由基的清除能力(n = 3)

2.4 山香圆叶挥发油的抗炎活性

在评价药物对细胞的活性之前，需要考察不同药物浓度对细胞毒性的研究，本研究中山香圆叶挥发油浓度为20～80 μg /mL的组别中，细胞存活率与正常对照组比较无显著性差异，但当其浓度为100～160 μg/mL时均对细胞有显著的毒性(P<0.01)，如图5所示，因此，选择20～80 μg /mL浓度范围进行后续实验。

图5 MTT法测定药物对RAW 264.7细胞活性影响

药物对LPS诱导的RAW 264.7细胞NO和IL-6分泌的影响结果如图6所示，与对照组相比，模型组的NO和IL-6释放量显著升高(P<0.01)。与模型组相比，山香圆叶高、中、低剂量组均能显著抑制NO和IL-6的释放量(P<0.01)，且随着药物剂量的增加，IL-6的抑制率也逐渐增加，NO的抑制率则先减少后增加，都在高剂量组显示出最佳的抑制结果，表明山香圆叶挥发油可显著抑制炎性因子释放且一定浓度范围内呈现剂量依赖性。

图6 山香圆叶挥发油对LPS诱导的RAW 264.7细胞NO和IL-6分泌的影响

3 讨论与结论

化学成分显著影响天然产物的活性和应用前景。从GC-MS的分析结果可以得到亚油酸类及角鲨烯等为其主要的成分。亚油酸类具有较好的生物活性，能够调节免疫功能，帮助糖原重新合成和增强骨钙化，并可以增加脂肪成分的分解，减少脂肪的累积，进而保护心血管系统[12-14]。类似的作用可见于(-)-α-蒎烯[15]。而且，(-)-α-蒎烯还具有抗菌作用和神经保护作用，能够减少细菌性胃肠炎的感染以及减轻缺血性中风时的神经炎症和细胞凋亡[16,17]。另外，角鲨烯作为山香圆叶挥发油中主要成分，具有广泛的药理作用，被广泛应用于保健品、美容产品及药品的开发中，能增强机体组织氧的利用能力，抵抗机体因缺氧而引起的各种疾病，并提高人体耐力，改善心功能。具有保肝、保肾皮质功能及抗肿瘤的作用。因此，山香圆叶挥发油具有广泛保健品和药品的开发前景。

另外，LC-MS鉴定到的挥发油中中小极性物质中的萜类化合物被证明了在神经保护方面具有重要作用[18,19]，苯丙素类化合物对神经退行性疾病例如阿尔茨海默病以及相关的神经炎症也具有潜在的治疗作用[20,21]。越来越多的研究表明挥发油的有效成分在神经疾病方面具有一定的药理作用，但这些有效成分的具体作用机制仍需进一步探明，这也指明了挥发油在未来的研究方向。