硫黄素T与侧翼连接双链DNA的G-四链体高特异性作用

周蔚，李运超，范楼珍，李晓宏

北京师范大学化学学院，北京 100875

1 引言

G-四链体(G4)是由离子诱导富G碱基的DNA序列形成的DNA二级结构，包括平行的G4，反平行的G4以及混合结构的G41，因而呈现了多型性。人体中有大量的富G序列，主要分布于端粒和原癌基因启动子区域，这些序列与细胞调控过程紧密相关2。另外，目前已有许多人工合成的富G序列用于设计发展纳米材料和分子器件3-14。G4的结构与性质直接影响到其在体内的生物功能和体外的生化应用15,16。其中，G4结构与荧光小分子的结合强度，直接决定了体内生物功能的性能和体外检测的可靠性和可行性17-21。因此，荧光小分子与G4的高效相互作用广受关注，也是研究热点22,23。

在研究荧光小分子与G4结构相互作用时，存在两方面的问题。荧光小分子(如：结晶紫，原卟啉，锌卟啉和硫黄素T等)仅仅与特定的G4结构结合。例如：结晶紫与反平行的G4有效结合24，原卟啉和锌卟啉与平行的G4有效结合25，硫黄素T与混合结构G4有效结合26。此外，为了实现与特定G4结构的高效结合，需要设计合成特异性的荧光小分子27。同时，结合体系中共存的离子以及离子的浓度，极大地影响荧光小分子与G4结构有效相互作用，这也是基于G4的光电传感器在实际体系中难于推广的主要原因28。例如：Na+会极大地影响K+稳定G4结构与荧光小分子的有效结合26。因此，如何实现荧光小分子对G4结构的普适性有效结合，并且不受体系中共存Na+的干扰，依然是一个严峻的挑战。

在本文中，以凝血酶适体链TBA(thrombin binding aptamer)为例，通过在TBA的3’端和5’端设计两条可互补的，含有10个碱基的单链DNA(TBA-10 bp)，由K+诱导TBA-10 bp形成K+稳定TBA结构(K+-TBA，G4)并衔接含有10对互补碱基的双链DNA(K+-TBA-10 bp)。相较于K+-TBA，荧光小分子硫磺素T与K+-TBA-10 bp结合后，产生了100倍的荧光增强，亲和强度增加了1000倍，重要的是不受结合体系中Na+(5-140 mmol·L-1)的影响。结合紫外-可见光谱，荧光光谱和圆二色光谱解析荧光增强机制，发现硫磺素T有效地嵌入K+-TBA与双链DNA衔接的空腔里。随后，将这一特殊的结合模式推广到其他的G4结构。这一工作，为实现荧光小分子与G4结构的有效相互作用，提供了新视角。

2 实验部分

2.1 实验材料

三羟甲基氨基甲烷(Tris)(纯度≥ 99.5%)，硫黄素T(纯度≥ 95.0%)，醋酸钠(纯度≥ 99.0%)，醋酸钾(纯度≥ 99.0%)。实验中使用的DNA由上海生工生物有限公司合成，具体序列如表1所示。

表1 本文中用到的DNA序列Table 1 Oligonucleotides used in this work.

2.2 实验方法

2.2.1 荧光光谱分析

室温下，使用FS5荧光光谱仪(Edinburgh instruments，UK)测试DNA溶液的荧光光谱图。比色皿光路长度为1 mm，体积为800 μL。对于硫黄素T激发波长是425 nm，记录440至580 nm的荧光光谱，读取495 nm的发射峰值。荧光测试中，所有溶液溶于pH=7.4的缓冲溶液(10 mmol·L-1Tris-Ac，20 mmol·L-1NaAc和10 mmol·L-1KAc)中，DNA与硫黄素T混合后，最终DNA浓度均为1 μmol·L-1，硫黄素T浓度为1 μmol·L-1。

2.2.2 荧光光谱滴定分析

为了测定硫黄素T和不同DNA的亲和性，用DNA对硫黄素T进行荧光滴定，计算两者的解离常数。200 nmol·L-1硫黄素T和不同浓度的DNA(0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1，2，3，4，5，6，8，10 μmol·L-1)相混合；室温下3 min后，测定硫黄素T在495 nm处的荧光谱值。

荧光滴定数据的分析，通过公式29：

其中，Q=Fmax/F0，A=KD/CThT，X=n × CDNA/CThT，F0为无DNA条件下硫黄素T的背景荧光强度，Fmax为硫黄素T饱和荧光强度，n为硫黄素T的结合比例，KD为解离常数。

2.2.3 紫外光谱分析

室温下，使用UV-2450紫外-可见分光光度计(日本岛津)记录在500至350 nm波长范围内硫黄素T的吸收光谱。紫外测试中，所有溶液溶于pH=7.4的缓冲溶液(10 mmol·L-1Tris-Ac，20 mmol·L-1NaAC和10 mmol·L-1KAC)中，DNA与硫黄素T混合后，最终DNA浓度均为10 μmol·L-1，硫黄素T浓度为5 μmol·L-1。

2.2.4 圆二色谱图(CD)测量

室温下，用Chirascan型圆二色谱仪(Applied Photophysics Ltd.)测量2 μmol·L-1DNA溶液的圆二色谱图。比色皿光路长度为1 mm，体积为800 μL。测试过程中通入高纯氮，扫描范围为220至360 nm，每个测试波长的停留时间为0.5 s，每个样品重复测试两次，最终谱图需扣除测试缓冲液的背景。

2.2.5 熔解曲线测量

使用Chirascan型圆二色谱仪对4 μmol·L-1TBA-10 bp进行圆二色谱熔解曲线测试。设定测试温度范围为20-90 °C，变温速率为0.5 °C·min-1，每0.5 °C测试一个点，获得在20-90 °C范围内，TBA-10 bp特征峰值(290 nm处的值)随温度变化曲线，即圆二色谱熔解曲线。

3 结果与讨论

3.1 硫磺素T与K+-TBA-10 bp的作用

在pH=7.4的缓冲溶液(10 mmol·L-1Tris-Ac，20 mmol·L-1NaAC 和 10 mmol·L-1KAC)中 ， 1 μmol·L-1的硫磺素T在495 nm处呈现出极弱的荧光，如图1所示。当加入1 μmol·L-1的凝血酶适体链(thrombin binding aptamer，TBA)时，K+诱导TBA形成K+稳定TBA(K+-TBA，G4)30。硫磺素T通过与K+-TBA作用，在495 nm处的荧光发射峰略有增强，表明硫磺素T能与K+-TBA弱结合30,31。同样地，当加入1 μmol·L-1DNA(1)与DNA(2)杂化后形成的双链DNA(1+2)，硫磺素T在495 nm处的发射荧光几乎不变，这表明硫磺素T与双链DNA(1+2)的相互作用依然很弱。当加入1 μmol·L-1的TBA-10 bp(TBA的3’端和5’端分别连接DNA(1)和DNA(2))，硫磺素T的发射荧光显著增加，相较于K+-TBA，增加了100倍。据文献报道，硫磺素的发射荧光增强源于硫磺素T分子的平面性增加16。由此我们推测，硫磺素T与K+-TBA-10 bp的结合很大程度上增加了硫磺素T分子的平面化。

图1 硫黄素T以及分别在TBA，DNA(1+2)或TBA-10 bp存在时的荧光光谱Fig.1 Fluorescent spectra of ThT in absence and presence of TBA,DNA(1+2)or TBA-10 bp.

3.2 硫磺素T与K+-TBA-10 bp的作用位点

为了说明硫磺素T与K+-TBA-10 bp的结合模式，首先考察了硫磺素T与DNA作用后的平面性，如图2a所示。硫磺素T在412 nm处有一个特征吸收峰32。与10 μmol·L-1TBA在缓冲体系中混合后形成K+-TBA，吸收峰出现了7 nm(419-412 nm)的红移；与10 μmol·L-1ds-DNA(1+2)混合后，吸收峰红移了3 nm(415-412 nm)；而加入10 μmol·L-1TBA-10 bp时，TBA-10 bp转化为K+-TBA-10 bp，硫黄素T的吸收峰红移了40至452 nm处。结果表明硫黄素T可以特异性地与K+-TBA-10 bp结合33。接着，考察了硫磺素T与K+-TBA-10 bp的亲和常数。通过荧光滴定法，拟合滴定曲线测得的解离常数KD为1.61 ×10-8mol·L-1，结合比例为1:1(图2b)。

同样地，硫磺素T与K+-TBA作用后的解离常数KD为1.63×10-5mol·L-1(图2c)，硫磺素T与双链DNA(1+2)作用后的解离常数KD为1.95×10-5mol·L-1(图2d)。相较于K+-TBA，硫磺素T与TBA-10 bp的亲和能力增加了近1000倍。这些结果说明，硫磺素T与K+-TBA-10 bp的强相互作用导致了硫磺素T分子的平面性增加，因而产生了100倍增强的发射荧光

图2 (a)硫磺素T以及在TBA，ds-DNA(1+2)，TBA-10 bp存在时的紫外-可见光谱;(b)0-5 µmol·L-1 TBA-10 bp,(c)0-10 μmol·L-1 TBA and(d)0-10 μmol·L-1 ds-DNA(1+2)对硫磺素 T(200 nmol·L-1)的荧光滴定曲线。F0表示硫黄素T的荧光强度；F表示存在DNA时硫黄素T的荧光强度Fig.2 (a)UV-Vis spectra of ThT in absence and presence of TBA,ds-DNA(1+2)or TBA-10 bp.Fluorometric titration curves of ThT(200 nmol·L-1)with 0-5 μmol·L-1 TBA-10 bp(b);0-10 μmol·L-1 TBA(c)and ds-DNA(1+2)(d).F0 and F denote the fluorescence intensity of ThT in the absence and presence of TBA,ds-DNA(1+2)or TBA-10 bp.

为了进一步说明硫磺素T与K+-TBA-10 bp的结合位点，采用圆二色光谱表征了K+-TBA-10 bp的构型，如图3a所示。缓冲体系中的TBA(K+-TBA)在291和248 nm处呈现两个正峰，265 nm处呈现一个负峰，这表明K+-TBA形成了反平行的G4结构34。ds-DNA(1+2)在280 nm处呈现一个正峰，在248 nm处呈现了一个负峰，表明ds-DNA(1+2)属于B型双链DNA35。而缓冲体系中的TBA-10 bp(K+-TBA-10 bp)在28到290 nm处出现了一个很宽的正峰，246 nm处有一个负峰。据文献报道36，将K+-TBA-10 bp的谱图减去ds-DNA(1+2)的谱图，得到图3a内图所示曲线：291和248 nm处有两个正峰以及265 nm处有一个负峰，同反平行K+-TBA结构谱图类似。这表明K+-TBA-10 bp是K+-TBA连接双链DNA的结构。硫磺素T与K+-TBA和K+-TBA-10 bp结合的热稳定性表明，K+-TBA的解链温度约为31.1 °C，K+-TBA-10 bp的解链温度升高到41.5 °C(图3b)。结合紫外可见光谱与解离常数测试结果，表明：(1)硫磺素T与K+-TBA和ds-DNA(1+2)结合较弱，(2)硫磺素T与K+-TBA-10 bp的结合呈现出极大的增强，(3)K+-TBA-10 bp是K+-TBA连接双链DNA的结构。基于此，我们推测硫磺素T可能嵌合在K+-TBA与双链DNA接壤处的空腔，体现出一种特异性的结合模式。

图3 (a)缓冲体系中TBA，ds-DNA(1+2)和TBA-10 bp圆二色谱图。内图：TBA-10 bp的圆二色谱图减去ds-DNA(1+2)的圆二色谱图。(b)10 mml·L-1 K+中TBA-10 bp 熔解曲线(黑线)，10 mml·L-1 K+和30 μmol·L-1 硫黄素T中TBA-10 bp 熔解曲线(红线)Fig.3 (a)CD spectra for TBA,ds-DNA(1+2)or TBA-10 bp in buffer solution.Inset:CD spectra of TBA-10 bp subtracting that of ds-DNA(1+2).(b)Melting curves of TBA-10 bp in the presence of 10 mmol·L-1 K+(black line)，10 mmol·L-1 K+ and 30 μmol·L-1 ThT(red line).

为了证实硫磺素T嵌合在K+-TBA与双链DNA衔接处的空腔，变化了K+-TBA和双链DNA的结构。当TBA-10 bp在不含有K+的缓冲体系中，圆二色谱图在280 nm处出现一个正峰，246 nm处出现一个负峰(图4a，黑线)。与含有K+的圆二色谱图有些许偏差，但不甚明显(图4a，红线)。此时，减去双链DNA的圆二色谱图，得到图4a内图所示的谱图，相较于含有K+的情况，G4结构的特征峰消失，说明在无K+条件下，K+-TBA没有形成。加入硫磺素T之后，在495 nm处的发射荧光降低，如图4b所示。这表明K+-TBA部分对于硫磺素T与K+-TBA-10 bp的结合至关重要。同样地，当变化TBA-10 bp 3’端和5’端的互补碱基数由2至18时，随着碱基数的增多，硫磺素T的荧光强度逐渐增加，当互补碱基增加到10对后，荧光强度不再变化(图4b)，这表明硫磺素T与K+-TBA-10 bp的结合同样依赖于稳定的双链部分。此外，将紧邻K+-TBA的A-T碱基对改变成G-C(K+-TBA-10 bp-GC)，C-G(K+-TBA-10 bp-CG)和T-A(K+-TBA-10 bp-TA)互补碱基对，或者A-A(K+-TBA-10 bp-AA)，T-T(K+-TBA-10 bp-TT)和C-C(K+-TBA-10 bp-CC)错配碱基对，继续与硫磺素T结合，荧光强度均呈现出不同程度的下降(图5a)。基于此，我们认为硫磺素T是高效地嵌合于K+-TBA与双链DNA(1+2)衔接处的空腔内，如图5b所示。

图4 (a)含K+和不含K+的缓冲体系中TBA-10 bp圆二色谱图。内图：对应的TBA-10 bp圆二色谱图减去ds-DNA(1+2)圆二色谱图。(b)硫黄素T与不含K+的TBA-10 bp，以及含 10 mmol·L-1 K+的 TBA-10 bp，TBA，TBA-2 bp，TBA-4 bp，TBA-8 bp和TBA-18 bp结合后在495 nm处的发射荧光强度Fig.4 (a)CD spectra for TBA-10 bp in the absence and presence 10 mmol·L-1 K+ in buffer solution.Inset:CD spectra of TBA-10 bp in the absence(black line)and presence 10 mmol·L-1 K+(red line)subtracting that of ds-DNA(1+2).(b)Intensity of fluorescent emission of ThT at 495 nm upon binding with TBA-10 bp in the absence of 10 mmol·L-1 K+,and TBA-10 bp,TBA,TBA-2 bp,TBA-4 bp,TBA-8 bp and TBA-18 bp in presence of 10 mmol·L-1 K+.

图5 硫黄素T分别与K+-TBA-10 bp，K+-TBA-10 bp-GC，TBA-10 bp-CG，TBA-10 bp-TA，TBA-10 bp-AA，TBA-10 bp-TT或TBA-10 bp-CC结合后的荧光谱图Fig.5 Fluorescent spectra of ThT in presence of K+-TBA-10 bp,K+-TBA-10 bp-GC,TBA-10 bp-CG,TBA-10 bp-TA,K+-TBA-10 bp-AA,TBA-10 bp-TT or TBA-10 bp-CC.

3.3 硫磺素T与K+-TBA-10 bp作用的抗Na+干扰性

高浓度的Na+会极大地影响G4结构与荧光小分子配体的有效结合26。那么K+-TBA衔接双链DNA(1+2)与硫磺素T的结合是否受Na+的影响？采用荧光滴定技术考察了解离常数对Na+浓度的依赖度，如图6示。在含有5 mmol·L-1Na+的缓冲体系中，测得的解离常数为1.588 × 10-8mol·L-1(图6a)。类似地，在含有20 mml·L-1Na+的缓冲体系中，测得的解离常数为1.614 × 10-8mol·L-1(图6b)；在含有50 mmol·L-1Na+的体系中，测得的解离常数为2.011 × 10-8mol·L-1(图6c)；在140 mmol·L-1Na+的缓冲体系中，测得的解离常数为2.142 × 10-8mol·L-1(图6d)。这一结果表明，K+-TBA衔接双链DNA(1+2)与硫磺素T的结合不受Na+的影响，体现出优质的抗Na+干扰能力。

图6 不同 Na+浓度下，0-5 µmol·L-1 K+-TBA-10 bp 对硫磺素 T(200 nmol·L-1)的荧光滴定曲线:(a)5 mmol·L-1 NaAc，(b)20 mmol·L-1 NaAc，(c)50 mmol·L-1 NaAc，(d)140 mmol·L-1 NaAc。F0 表示没有K+-TBA-10 bp时硫黄素T的荧光强度；F表示存在K+-TBA-10 bp时ThT的荧光强度.Fig.6 Fluorometric titration curves of ThT(200 nmol·L-1)with 0-5 μmol·L-1 K+-TBA-10 bp in the presence of various Na+ concentrations:(a)5 mmol·L-1,(b)20 mmol·L-1,(c)50 mmol·L-1 and(d)140 mmol·L-1 NaAc.F0 and F denote the fluorescence intensity of ThT in the absence and presence of K+-TBA-10 bp.

3.4 硫磺素T与K+-TBA-10 bp作用模式的普适性

硫磺素T作为一个与混合结构G4特异性相互作用的荧光小分子，几乎不能有效地与平行G4和反平行G4结合21。这本文中，K+-TBA是一种最简单的反平行G4结构，而硫磺素T可以与K+-TBA-10 bp有效相互作用。随后，将这一特异性结合模式推广到其他富G适体链。据文献报道，K+存在下，富G适体链PW1737、T3TT38、T3TT338和c-kit39形成平行的G4结构，Oxy2840、Hum2438和PS2.M41形成反平行的G4结构。用这些具有代表性的富G适体链代替TBA-10 bp中的TBA部分，在K+诱导下形成K+稳定的G4结构并衔接双链DNA(1+2)(K+-G4-10 bp)。加入硫磺素T，通过硫磺素T发射荧光的增加程度衡量相互作用效果，结果如图7所示：同K+-G4本身(黑色柱)相比，K+-G4-10 bp(红色柱)与硫磺素T结合后，硫磺素T的发射荧光强度明显地增加。结果表明，对于富G适体链，在3端和5端增加碱基数，形成G4结构后并衔接稳定双链DNA的结构，可以有效地增加与硫磺素T的相互作用强度，且与G4的构型无关。

图7 硫磺素T与K+-G4(黑色柱)和K+-G4-10 bp(红色柱)结合后在495 nm处的荧光强度Fig.7 The fluorescence intensities of ThT at 495 nm upon binding with G-rich DNA sequences(black)and G-rich DNA sequences flanking with ds-DNA(red).

4 结论

综上所述，在凝血酶适体链TBA的5’端和3’端分别增加10个碱基(TBA-10 bp)，K+诱导TBA形成K+稳定的TBA(K+-TBA)并衔接10对互补碱基的双链DNA(K+-TBA-10 bp)。相较于K+-TBA，K+-TBA-10 bp与荧光小分子硫磺素T结合后，硫磺素T的荧光强度增加了100倍，亲和强度增加了1000倍，最重要的这一结合模式不受Na+(5-140 mmol·L-1)的影响。这些结合性能的改善得益于硫磺素T有效地嵌合在K+-TBA和双链DNA衔接的空腔内。这一特殊的结合模式普遍适用于其他的G4结构。所以，硫磺素T可以成为一种广谱荧光探针识别G4结构，不依赖于G4结构的多型性，也不依赖于体系中的Na+浓度，在生物化学和生化分析领域，体现出潜在的应用价值。