防风通圣丸改善多囊卵巢综合征大鼠胰岛素抵抗的作用研究

韩方，张荧，蒯顾平，任青玲，胡荣魁*

(1.南京中医药大学附属医院,江苏 南京 210029；2.南京中医药大学医学院·整合医学学院,江苏 南京 210023)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一种育龄女性常见的异质性生殖内分泌综合征，其在育龄女性中的发病率约为6%～19%[1]。PCOS以慢性无排卵(排卵功能紊乱或丧失)、高雄激素血症和多囊卵巢为典型特征。PCOS患者常易发展为代谢综合征，具体表现为胰岛素抵抗、高胰岛素血症、腹型肥胖、高脂血症[1-2]。研究发现胰岛素抵抗在PCOS患者中的发病率高达70%，是导致PCOS生殖、代谢异常的关键因素之[2-3]。

PCOS多归属于中医学“月经失调”“闭经”“崩漏”“不孕”等疾病的范畴。《女科切要》曰：“肥白妇人，经闭而不通者，必是痰湿与脂膜壅塞之故也。”万全在《万氏妇人科》中提出：“惟彼肥硕者，膏脂充满，元室之户不开，挟痰者痰涎壅滞，血海之波不流，故有过期而经始行，或数月经一行，及为浊，为带，为经闭，为无子之病。”朱震亨在《丹溪心法》中记载：“若是肥盛妇人，禀受甚厚，恣于酒食之人，经水不调，不能成胎，谓之躯脂满溢，闭塞子宫，宜行湿燥痰。”可见古代医家认为PCOS多与痰湿有关。临床横断面研究显示，痰湿体质者较非痰湿体质者血糖、胰岛素水平更高，更易出现胰岛素抵抗[4]。胰岛素抵抗导致的糖、脂代谢障碍又被证实是痰湿的现代生物学基础之一，因而胰岛素抵抗被认为是痰湿形成的病理生理基础[4-5]。

国医大师夏桂成教授通过对多囊卵巢综合征分型的长期研究，发现痰湿肥胖型多囊卵巢综合征存在阴虚及阳者较多，这是因为本病长期处于经后期的状态，阴虚阳弱甚至有阴无阳，阴虚则精卵不能成熟，不能顺利阳长，阴不足则阳长欠盛，阳虚易致水湿内停，酿生痰湿，进而凝结为痰脂，导致肥胖。同时，阴阳转化不利，气血津液不能和畅，也易于酿生痰湿、甚至留瘀，从而导致多囊卵巢综合征复杂的病理过程和多样的病理产物。夏桂成教授主张治疗痰湿闭经应从减肥、通经、调周期方面入手, 认为痰浊脂肪蕴塞，大便秘结之肥胖，当给予防风通圣丸治疗，以达到表里双解、通腑泄热的目的[6]。本研究采用来曲唑构建胰岛素抵抗型PCOS大鼠模型，观察防风通圣丸对胰岛素抵抗型PCOS大鼠的疗效并探查其可能的作用机理，为临床使用防风通圣丸治疗胰岛素抵抗型PCOS提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF级雌性21日龄SD大鼠20只，体质量150～180 g，动物许可证号：SCXK(浙)2019-0002，购自浙江省医学科学院。动物入室后常规饲养于屏障环境，自由饮水，12 h交替照明，室温(22±3)℃，相对湿度40%～70%。

1.1.2 实验药物

来曲唑(美国诺华制药公司)；防风通圣丸(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂)，药物组成：防风、荆芥穗、薄荷、麻黄、大黄、芒硝、栀子、滑石、桔梗、石膏、川芎、当归、白芍、黄芩、连翘、甘草、白术(炒)。

1.1.3 主要实验试剂与仪器

羧甲基纤维素(Sigma公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术公司)；苏木素、伊红染色液、游离自由脂肪酸检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；雌二醇、睾酮ELISA 检测试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司)；胰岛素ELISA 检测试剂盒(上海依科赛生物制品有限公司)；V型胶原酶(Sigma公司)；胰岛素受体β(anti-Insulin Receptor β，IRβ)抗体(SANTA CRUZ生物科技公司)；抗小鼠抗体(南京润研生物科技有限公司)。Z326K型高速冷冻离心机(德国Hermle公司)；RM2235型切片机(上海徕卡仪器有限公司)；TEC-5-EMJ-2型石蜡包埋机(日本樱花检验仪器株式会社)；1708265型ChemiDocXPS+化学发光成像系统，1703930型湿转印槽，1658001型小垂直板电泳槽(美国Bio-Rad公司)；1510型全波长酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物建模

21日龄雌性SD大鼠适应性喂养3 d后，随机分为正常对照组(6只)和模型组(14只)。模型组将芳香化酶抑制剂来曲唑(1.0 mg/kg)溶于1%羧甲基纤维素(2 mg/kg)中，每日灌胃，连续21 d，正常对照组则每日给予等量的0.5%羧甲基纤维素，连续21 d，于造模第12天开始每日阴道涂片，观察各组大鼠动情周期变化，连续10 d，成功诱导PCOS大鼠13只。

1.2.2 分组、给药

13只PCOS大鼠随机分为模型组(6只)、防风通圣丸组(7只)。防风通圣丸组按照人鼠体质量比的1倍计算每日灌胃给药剂量，连续14 d；正常对照组、模型组则每日灌服水，连续14 d。

1.2.3 血清激素水平测定

实验干预结束后，于干预末日20∶00开始禁食，次日8∶00腹腔注射10%水合氯醛麻醉，抽取腹主动脉血5 mL，离心血液标本，取血清，按照试剂盒说明操作，ELISA法测定血清雌二醇、睾酮浓度。

1.2.4 血清糖、脂代谢指标测定

全自动生化分析仪检测血糖、血脂(包括胆固醇、甘油三酯)浓度；微量法测定血清游离脂肪酸浓度；ELISA法测定血清胰岛素浓度；计算胰岛素抵抗(HOMA-IR)指数，HOMA-IR =空腹血糖(mmol/L)×空腹胰岛素(mIU/L)/22.5。

1.2.5 卵巢组织病理形态检测

留取右侧卵巢组织，置于4%福尔马林固定，蜡块包埋，HE染色，显微镜观察卵巢组织的病理学形态。

1.2.6 葡萄糖刺激胰岛素分泌实验

摘取胰腺，剪刀切碎胰腺，将胰腺置于0.5% V型胶原酶溶液中，37 ℃恒温水浴中消化15 min, 10%胎牛血清终止消化，250×g4 ℃离心1 min，重复2次，显微镜下，挑出胰岛。参照文献[7-8]，将胰岛在37 ℃和5% CO2的标准Krebs-Ringer碳酸氢盐(KRB)溶液中预孵育1 h，然后在补充有3.3 mmol/L葡萄糖的KRB中洗涤、孵育1 h，随后用含有16.7 mmol/L葡萄糖的KRB中孵育1 h。每次处理后收集上清液，ELISA法测定上清胰岛素浓度。

1.2.7 Western blotting测定骨骼肌(比目鱼肌)IRβ蛋白水平

按照蛋白裂解液提取试剂盒说明书要求提取各组比目鱼肌总蛋白，按比例加入裂解液后置于匀浆机研磨，随后置碎冰上裂解1 h，4 ℃条件下12 000 r·min-1离心15 min，取上清液，按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书检测各组蛋白浓度。取各组30 μg蛋白上样，电泳，浓缩胶电压70 V，分离胶90 V。转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗稀释液(抗IRβ1∶1 000)4 ℃孵育过夜，加入二抗稀释液(1∶3 000)室温孵育1 h，ECL发光显色，曝光。使用Image J图像分析软件进行分析灰度值。

1.2.8 统计学方法

采用SPSS Statistics 20.0软件处理，所有计量资料以均数±标准误表示，进行单因素方差分析，多组间两两比较采用Student-Newman-Kueuls检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体质量、性腺旁脂肪组织重量检测

实验结束后，模型组大鼠体质量、性腺旁脂肪重量显著高于正常对照组(P<0.05)；防风通圣丸组体质量、性腺旁脂肪重量显著低于模型组(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠实验结束体质量、性腺旁脂肪组织重量比较

2.2 血清性激素水平检测

模型组血清雌二醇水平较正常对照组显著降低(P<0.05)，防风通圣丸组血清雌二醇水平较模型组显著升高(P<0.05)；模型组血清睾酮水平显著高于正常对照组(P<0.05)，防风通圣丸组血清睾酮水平较模型组显著降低(P<0.05)，见表2。

2.3 卵巢组织形态学观察

光镜下正常对照组见黄体和处于不同发育阶段的卵泡，卵泡颗粒细胞约9～16层，排列整齐、紧密，卵泡内见放射冠以及卵母细胞(图1A)；模型组见黄体和多个囊性扩张的卵泡，卵泡体积增大，卵泡中卵母细胞或放射冠消失，颗粒细胞极薄约2～4层，排列疏松(图1B)；防风通圣丸组黄体及处于不同发育阶段的卵泡数量介于正常对照组和模型组之间, 部分卵泡内可见卵母细胞、放射冠，颗粒细胞增厚约为8～10层，排列较紧密(图1C)。

图1 卵巢组织学图片( HE，×400)

2.4 糖代谢、脂代谢水平检测

模型组空腹血糖水平、空腹胰岛素水平、HOMA-IR指数、胆固醇、甘油三酯、自由脂肪酸较正常对照组显著升高(P<0.05)，防风通圣丸组空腹血糖水平、空腹胰岛素水平、HOMA-IR指数、胆固醇、甘油三酯、自由脂肪酸较模型组显著降低(P<0.05)，见表3。

表3 各组大鼠糖代谢与脂代谢水平比较

2.5 葡萄糖刺激胰岛分泌胰岛素实验

模型组3.3 mmol/L葡萄糖、16.7 mmol/L葡萄糖刺激胰岛分泌胰岛素较正常对照组显著升高(P<0.05)，防风通圣丸组3.3 mmol/L葡萄糖、16.7 mmol/L葡萄糖刺激胰岛分泌胰岛素PCOS 模型组显著降低(P<0.05)，见表4。

表4 各组大鼠葡萄糖刺激胰岛分泌胰岛素比较

2.6 骨骼肌(比目鱼肌)IRβ蛋白水平

模型组比目鱼肌IRβ蛋白水平较正常对照组显著降低(P<0.05)，防风通圣丸组比目鱼肌IRβ蛋白水平较模型组显著上调(P<0.05)，见图2。

注：A.蛋白条带图；B.蛋白相对表达量图。C.正常对照组；M.模型组；F.防风通圣丸组。与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。图2 各组大鼠比目鱼肌IR-蛋白条带图及水平比较

3 讨论

防风通圣丸是金元四大家之一刘完素创立的名方，出自《黄帝素问·宣明论方》，由防风、荆芥、薄荷、麻黄、大黄、芒硝、栀子、滑石、桔梗、石膏、川芎、当归、白芍、黄芩、连翘、甘草、白术共17 味中药组成。本方集汗下清补于一方, 分消表里邪热, 兼顾气血, 驱邪而不伤正，具有通里解表、清热解毒的功效。

本实验研究结果显示，经防风通圣丸治疗的胰岛素抵抗型PCOS大鼠，胰岛素抵抗明显改善，空腹血糖、胰岛素水平及HOMA-IR指数显著降低。外周靶组织的胰岛素作用受损(即外周胰岛素抵抗) 、胰岛素分泌缺陷是导致胰岛素抵抗的机制。骨骼肌是影响机体糖代谢的主要器官之一，其承担了机体85%由胰岛素刺激引起的葡萄糖转运[9]。因此，骨骼肌作为胰岛素作用的主要靶器官，在胰岛素抵抗的病理生理过程中发挥着重要作用。骨骼肌中IR-β是葡萄糖的主要利用者，在维持机体葡萄糖水平中起关键作用。胰岛素受体为酪氨酸蛋白激酶型受体，由IR-α和IR-β亚单位组成，胰岛素与IR-α结合后，引起IR-β的酪氨酸磷酸化，并在胰岛素受体底物的参与下，激活磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)，活化的PI3K在骨骼肌细胞中促进葡萄糖转运蛋白4移位到细胞膜上，促进骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取[10]。研究显示肥胖、Ⅱ型糖尿病患者骨骼肌IR-β蛋白水平降低[10-11]。MISHRA等[8]研究显示二氢睾酮(dihydrotestosterone，DHT)诱导的胰岛素抵抗型PCOS大鼠骨骼肌IR-β蛋白水平降低。本研究显示，PCOS模型大鼠比目鱼肌IR-β蛋白水平降低，经防风通圣丸治疗后目鱼肌IR-β蛋白水平上调。此外，本研究显示模型组分离的胰岛表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌较正常大鼠的胰岛增加，表明来自模型组的胰岛产生更高水平的胰岛素。而从防风通圣丸组分离的胰岛表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌较模型组分离的胰岛降低，表明来自防风通圣丸组的胰岛分泌胰岛素缺陷改善。

胰岛素抵抗是导致PCOS患者生殖、代谢异常发病机制的核心组成部分。胰岛素通过胰岛素样生长因子-1受体介导，刺激卵巢产生雄激素，雄激素升高阻碍卵泡发育并诱导其在成熟前闭锁，维持持续无排卵状态，卵巢内升高的雄激素抑制芳香化酶活性，阻碍雌激素生成。血清高胰岛素血症还可通过减少肝脏SHBG的合成，导致游离睾酮含量增加，从而导致PCOS的高雄激素血症。高雄激素血症导致脂肪细胞功能失调，进一步影响糖、脂质代谢和卵泡生长发育。胰岛素通过抑制脂肪组织释放自由脂肪酸调节脂质氧化代谢，胰岛素抵抗患者的这种抑制作用被打破，导致血液中自由脂肪酸增多，流经肝脏的自由脂肪酸增多，加速甘油三酯合成[12-13]。本研究显示防风通圣丸可明显降低胰岛素抵抗型PCOS大鼠的睾酮水平，提升PCOS大鼠雌二醇水平，并改善PCOS大鼠脂代谢及卵泡生长发育。

综上所述，防风通圣丸能够改善胰岛素抵抗型PCOS模型大鼠糖、脂代谢异常，调控机体性激素水平，起到治疗PCOS生殖、代谢异常作用，其改善PCOS胰岛素抵抗分子机制为提高骨骼肌IR-β蛋白水平、降低葡萄糖刺激胰岛分泌胰岛素。