酶联免疫法检测饲料中沙丁胺醇含量的研究

康福忠

(天津市农业生态环境监测与农产品质量检测中心，天津 300402)

0 引言

沙丁胺醇(Salbutamol，SAI)属于一种人工合成制剂，是人工合成的β-肾上腺素激动剂，在畜禽饲料中应用该兴奋剂能够促使畜禽产生大量的蛋白质，进而导致胴体脂肪的含量逐渐减少[1]。在畜禽饲料中添加沙丁胺醇，畜禽体内易贮积大量沙丁胺醇，人在长期食用此类畜禽后容易出现晕眩、心悸、神经过敏、头痛以及肌肉颤动等现象，严重的还会出现肝脏损伤和糖尿病等，对人的生命健康带来严重威胁[2]。所以采用科学的方法测定饲料中沙丁胺醇的含量具有重要意义。酶联免疫法(ELISA)是重要的检测方法[3]。本文采用这种方法来测定饲料中沙丁胺醇的含量，并验证该方法的测定准确性。

1 材料和方法

1.1 所需仪器和实验样品

在本次研究中，应用仪器主要有离心机、沙丁胺醇试剂盒、移液枪、酶标分析仪以及微量振荡器等。本次研究采用的实验样品主要为豆粕。

1.2 实验方法

1.2.1 制备工作液

将工作液放置在冰箱中冷藏，在选取的过程中将工作液标本从冰箱中取出，待完成1 h的回温后进行备用；在选取酶标物工作液中，需要精确选取12 mL酶标物工作液，将其置于酶标物冻干粉瓶中，待其充分溶解后，将标本放置在22℃～25℃环境中，满足回温后的备用需求；在样品稀释工作液的配备中，用去离子水按照1:10的比例将10x稀释液稀释后进行备用；清洗液，用去离子水按照1:20的比例将20x稀释液稀释后进行备用；显色剂，采用回温的方式进行备用，且不可受到光线直照；工作液的准备环节中，终止液的回温和备用是重要步骤。

1.2.2 样品的前置处理

在样品的称取过程中，需要将豆粕分为4等份，每份称取0.5 g，将其分别放置在4只离心管中，并对这些离心管以1、2、3、4的方式进行编号(另取4份样品加入离心管中做平行试验，编号01～04，分别对应1～4)。在 2、3、 4号离心管分别加入8.1 ng/mL沙丁胺醇标准品0.5 mL。在此基础上，选择0.01 mol标准的盐酸溶液，在1～4号离心管中分别加入5 mL、1.5 mL、4.5 mL和7.5 mL溶液，将加入溶液的离心管放在微量振荡器之上进行震荡，满足溶液摇匀需求。将1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值，调节到7.6±0.4，并采用10 000 r/min的方式做2 min的离心处理，分别将离心后的上清液移取出来，移取100 μL，将其放置到另一比较干净的离心管中，将400 μL的样品稀释工作液加入到离心管中并对其编号，再将其放置在微量震荡器上进行震荡，满足均匀性需求。在4只试管中，采用的稀释倍数需要设置为50、20、50和80倍，且在1号试管中，沙丁胺醇的提取液浓度为0 ng/mL；2号试管中，沙丁胺醇的提取液浓度为0.406 ng/mL；3号试管中，沙丁胺醇的提取液浓度为0.163 ng/mL；4号试管中，沙丁胺醇的提取液浓度为0.104 ng/mL。在这些试管中分别提取出50 μL做检测试剂。

1.2.3 检测过程

检测时将多余的微孔移去，且将移去部分重新封存起来，同时对这些微孔板做好预编号措施，并有效标记好标准品以及样品的主要位置，在此基础上实施双孔平行实验。在开展实验的过程中需要分别加入50 μL的样品以及标准溶液，采用的浓度分别为0、0.1 ng/mL、0.3 ng/mL、0.9 ng/mL、2.7 ng/mL和8.1 ng/mL。在每个孔中需要加入酶标物100 μL，加入后采用轻摇的方式晃动反应板，并将其放置在25℃的环境中孵育30 min。待孵育完成后，将微孔中的液体倒掉，再将250 μL清洗液加入到其中，轻轻晃动反应板，并将微孔中的液体倒掉，同时将微孔板倒放在吸水纸上，通过轻拍的方式将微孔中的气泡以及残留液全面清除，通过这种方式反复做5次冲洗。完成此环节的冲洗后，需要将100 μL的显色剂加入到在相关的微孔中，多反应板进行适当晃动，使其保持均匀性，完成混匀之后再将其放置在25℃的环境中显色10 min。完成显色环节后，需要在每一个微孔中都加入100 μL终止液，且在10 min之内采用酶标仪，进而在450 nm波长环境下对吸光度进行检测，通过这种方式来得出检测数据。

2 结果分析

2.1 标准曲线分析

将不同标准溶液浓度表现出来的对数值设置为横坐标，而纵坐标的设置以吸光度B/B0为主，使用四参数logistic函数拟合后的标准曲线如图1所示。通过分析图1，发现该曲线中的IC50值主要以0.608 ng/mL为主，主要的线性范围保持在0.219～1.657 ng/mL，而R的值为0.997。得到的6个标准品的吸光度值如表1所示。

图1 沙丁胺醇标准曲线

2.2 样品回收率

通过对标准曲线进行分析，计算得出研究样品中的沙丁胺醇的回收率。豆粕在处理之前分别将其稀释50、20、50以及80倍，进而得出提取液的测定浓度，相关浓度数值如表2所示。通过对这些提取液的测定浓度以及加标的真实浓度分析，经计算能够得出相关样品的回收率。在空白试验中，豆粕提取液能够检测出其沙丁胺醇的含量，检测值为0.051 ng/mL，且低于检测限表明没有检出。同时，其他的加标样品呈现出来的回收率都大于90%，说明这种检测方法能够满足回收率的检测要求，表现出来的检测数据具有准确性和可靠性。

表2 阳性添加样品回收率

3 讨论

在当前的饲料中的沙丁胺醇含量的检测中，所采用的检测方法比较多样，但采用的检测方法和技术主要以两类为主，分别是色谱分析技术以及免疫分析技术，而在这两种技术中，涵盖了大量其他技术，比如在色谱分析技术中，涵盖的技术有气相色谱-质谱法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)以及气液相色谱-质谱法(LC-MS)等；而在免疫分析技术的研究中，比较常见的检测技术有荧光免疫测定法(FIA)、胶体金免疫层析实验测定法(GICA)以及酶联免疫吸附测定法(ELISA)等[4]。在这些方法的应用中，不管采用哪种检测方法其自身都有一定特点和优势。通过对色谱分析技术的研究，该技术的优点是检测结果比较精准，且灵敏度较高；但同时也具有一定的缺陷，比如分析速度比较慢，仪器设备的要求也比较高，处理过程比较复杂，检测成本比较高[5]。对于免疫分析技术进行研究，该技术的优点是检测操作比较便捷，且技术特异性比较强，能够采用成批检测的方式对样品进行检测，对设备仪器的要求也比较低，因而需要投入的检测成本并不高，同时检测灵敏度比较高[6]；缺点是在检测时有较多的影响因素，容易使检测出来的样品出现假阳性。

在本次研究中，实验采用的检测方法为酶联免疫法，该技术在检测的过程中是一种比较成熟的检测方法。通过实验发现在饲料中检测沙丁胺醇含量，采用酶联免疫法呈现出来的沙丁胺醇回收率比较高，全部样品的检测回收率都达到90%以上，且分析标准曲线相关系数，得出其系数值R为0.997，有效表明了在饲料中检测沙丁胺醇含量时选择酶联免疫法具有较强的准确性以及可靠性[7]。

这种技术的应用过程中，需要注意一些事项，以有效减少实验失误带来的误差，具体如下：①开展实验之前，需要仔细阅读试剂盒之上的说明书，不同试剂盒以及不同批次的试剂盒不可出现混淆现象，有效规避混用试剂盒带来的实验误差[8]。②开展实验之前，需要将相关试剂盒进行高效回温。③在样品的前处理过程中，需要有效调节pH值，进而规避由于提取液pH值不标准对检测结果产生影响。④开展检测操作加样的环节中，需要采用快速操作方式，通过这种方式来规避加样时间长短不一致的现象，保持准确性。⑤对各孔加入相关试剂的过程中，需要及时更换枪头，同时，在加入试剂时不可将枪头和微孔中的溶液或者是内表面相接触，规避交叉感染现象[9]。⑥在开展相关实验的过程中，需要采取措施来控制好湿度以及温度，此外，每个环节的反应时间也需要高度重视。⑦加入终止液之后，需要在10 min之内有效读取吸光度的值，通过这种方式来提高实验的准确性，降低对实验的影响。

4 结语

沙丁胺醇属于二代瘦肉精的替代品，人们食用含有大量沙丁胺醇食物时会产生较大的危害，严重影响人们的身心健康，对人体带来间接性影响[10]。因此，加强检测力度，有效控制畜禽体内的沙丁胺醇具有重要意义，而想要控制沙丁胺醇的含量，需要对饲料展开研究，通过采取科学的技术方法来检测饲料中沙丁胺醇的含量。而在本次实验中，借助酶联免疫法来检测饲料中的沙丁胺醇，通过实验研究结果分析，这种检测技术在应用的过程中对于沙丁胺醇含量的检测准确率比较高，且在开展实验时所需要的仪器设备比较简单，操作也相对便捷，能够呈现出较好的检测和应用效果，说明检测饲料中的沙丁胺醇含量可以借助酶联免疫法进行检测。