瘤胃菌中乳酸脱氢酶的异源表达与酶学性质研究

金紫阳，袁思棋，刘 君，2

（1.四川轻化工大学生物工程学院，四川宜宾 644000；2.宜宾五粮液集团有限公司，四川宜宾 644000）

乳酸脱氢酶（ldh）是一种广泛分布于植物、微生物和动物细胞内的重要功能酶，是糖酵解的关键酶之一，性质存在较大差异，能催化氧化还原反应，于生物体内氧化产能以及解毒等途径发挥关键作用。在哺乳动物中ldh-a、ldh-b 和ldh-c 3 个基因编码广泛分布于不同组织中的6 种结构相似的ldh蛋白，其中包括5 种由ldh-a 和ldh-b 基因编码的同工酶，以及一种由ldh-c基因编码并在睾丸和精子中表达的酶。在生物体内，ldh 在辅酶NAD/NADH 的作用下能催化丙酮酸与乳酸之间的可逆转化。在可逆转化时ldh每个亚基可以与单个辅酶分子以及单个底物分子相连结，以便独立发生转化，该转化有NAD的参与时，使乳酸被ldh 可逆地催化氧化去质子化，转化成H以及去质子化的丙酮酸，同时，NAD和来源于底物的H结合生成NADH。

在医学检测方面，ldh 是一种常用的临床诊断酶，是检测其他酶和生物制品的一种通用辅助酶，如检测丙氨酸氨基转移酶、肌激酶和丙酮酸激酶等酶活性。ldh 可检测人体血清中的丙酮酸含量，可用ldh 试剂盒对NK 细胞的活性进行检测。基于ldh 的广泛底物谱，ldh 可用于生产乳酸、苹果酸、苯乳酸和扁桃酸等高附加值有机酸。例如，乳酸和苹果酸均是安全的食品添加剂，已用于发酵奶制品、腌渍食品和饮料的生产。这些有机酸在食品、医药和材料等行业均有重要的应用价值。

课题组保存的1 株瘤胃菌R1 具有利用乳酸合成己酸的功能，在这个过程中，乳酸在乳酸脱氢酶和NADH 的催化下转化为丙酮酸，以丙酮酸作为中间体将羧酸链延长，降三碳的乳酸合成六碳的己酸。本研究从R1 中克隆获取乳酸脱氢酶基因，构建重组质粒pEGX-6p-1-，并转化到BL21(DE3)进行异源表达，研究重组的酶学性质，为随后的菌种分子改造与己酸发酵提供更加精确的理论基础，为工业应用提供指导依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

克隆表达菌株DH5α 和BL21(DE3)购自天根生化科技(北京)有限公司；瘤胃菌R1和质粒PEGX 6P-1 由实验室保藏。

1.1.2 试剂及耗材

培养基成分购自上海源叶生物技术有限公司；IPTG、氨苄青霉素购自生工生物工程股份（上海）有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒、DNA 快速回收纯化试剂盒、胶回收试剂盒购自OMEGA 公司；Ex Taq DNA 聚合酶及限制性内切酶BamH I 和Xho I均购自TaKaRa 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计

根据NCBI 数据库中已报道的瘤胃菌CPB6基因组中的ldh 基因（GenBank：CP020705.1）序列为模板，设计引物，对R1 提取DNA 后进行PCR 扩 增。ldh-F：5'-CGCGGATCCATGAAAACAAGAAAAATCGGCG-3'，下划线序列为BamHⅠ酶切位点；ldh-R：5'-CCGCTCGAGGTCGACGCAAAGGTCTTTTAGC-3'，下划线序列为Xho I 酶切位点。引物由成都擎科生物科技有限公司合成。

1.2.2 构建重组质粒

经过PCR 扩增得到ldh 基因片段。将扩增后的目的片段和pEGX 6p-1 载体使用相应的限制性内切酶酶切后，用T4 DNA 连接酶进行连接，转化至DH5α，挑取单菌落经菌落PCR 及提取质粒双酶切后送至成都擎科生物技术有限公司进行测序鉴定。

1.2.3 重组ldh的表达和纯化

挑取携带pGEX 6p-1-质粒的BL21(DE3)单菌落，至含Amp抗性的LB液体培养基中过夜培养。以2%的接种量转接到100 mL LB培养基中，37 ℃培养直至OD达到0.7 左右，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG，18 ℃过夜诱导。8000 r/min离心3 min 收集菌体细胞，PBS 重悬后超声破碎细胞，以10000 r/min、4 ℃离心20 min，收集上清液。用谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B 挂柱，PP 酶切除GST标签。SDS-PAGE 凝胶电泳检测目的条带，纯化后的蛋白于4 ℃冰箱保藏。

1.2.4 ldh生物信息学分析

根据测序结果使用ExPASy 网站提供的Prot-Param 工具对ldh 的氨基酸序列进行理化性质分析；亲疏水性特征使用ExPASy 网站的ProtScale 工具进行分析；使用在线工具NPSA server 中的SOPMA 进行ldh 的氨基酸序列二级结构分析和预测；使用CDD 和SMART 对ldh 保守结构的分析；ldh 信号肽的分析和预测采用工具SignalP 5.0 server；运用TMHMM 2.0 Server 进行ldh 的跨膜结构域的分析 和 预 测；使 用SWISS-MODEL 和I-TASSER 对ldh 进行3D 建模，以及使用SAVES 对模型进行评价。

1.2.5 ldh酶活测定

用0.1 mol/L pH7.5 的PBS 缓冲液配制80 mM的丙酮酸钠溶液和4 mM 的NADH 溶液，测定酶活前将溶液25 ℃水浴预热。取2 支光径为1 cm 的石英比色皿，1 支中加入3 mL 丙酮酸钠溶液，放在紫外分光光度计中，340 nm处调A值为0；另取1支比色皿依次加入2.9 mL 丙酮酸钠溶液和0.1 mL NADH 溶液，加盖摇匀后立即测定A，然后加入纯化后的酶液10 μL，立即计时，每隔30 s 测1 次A，连续测定3 min，计算ΔA。

1.2.6 ldh最适反应温度与温度稳定性

用0.1 mol/L pH7.5 的磷酸盐缓冲液配制底物丙酮酸钠溶液和辅酶NADH 溶液，在20～60 ℃条件下测定A并计算比活力，以最高反应速度作为100%反应活力，得到其他相对活力，100%反应活力对应的温度即为ldh的最适温度。

将酶液在15～75 ℃下分别放置4 h，每隔1 h测定一次A并计算比活力，将0 h 的酶活力作为100 %反应活力，记录不同温度下ldh 酶活力的变化情况。

1.2.7 ldh最适反应pH值及其稳定性

用pH5～8 的0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液分别配制底物丙酮酸钠溶液和辅酶NADH 溶液，在37 ℃反应并测定A并计算比活力，以最高反应速度作为100%反应活力，得到其他相对活力，100%反应活力对应的pH值即为ldh的最适pH值。

将酶液在pH5～8 的环境下放置4 h，每隔1 h测定一次A并计算比活力，将0 h 的酶活力作为100%反应活力，记录不同pH 值下ldh 酶活力的变化情况。

1.2.8 金属离子和EDTA对ldh酶活的影响

Mn、Ca等是某些酶的激活剂,在最适反应条件下,反应体系中添加3 mM 的NaCl、ZnCl、CaCl、MnSO、FeCl、CuCl、CoCl、MgCl和EDTA，研究不同金属离子对ldh酶活性的影响。将不加任何金属离子只加入等量缓冲液的对照组的酶活力作为100%反应活力，计算不同金属离子条件下的相对活力并分析结果。

2 结果与分析

2.1 ldh外源表达与蛋白质纯化

利用PCR 技术扩增出ldh 基因。PCR 产物用1%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1 所示，在1000 bp 左右出现单一条带，与预测的ldh基因长度964 bp一致，判定条带是目标产物。

图1 ldh的PCR扩增产物

图2 重组蛋白SDS-PAGE电泳图

对重组质粒pGEX-6p-1-在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达结果进行SDS-PAGE凝胶电泳验证检测。SDS-PAGE 结果显示经过12 h 诱导后，BL21(DE3)/ pGEX-6p-1-全 细 胞 在60 kDa附近出现一条明显的条带，与目的基因表达后的大小一致（含GST 标签），且在上清中表达，而未诱导的重组的菌株无该条带存在，初步表明添加IPTG 后，重组质粒pGEX-6p-1-在BL21(DE3)中得到了正确的可溶性表达。按照琼脂糖凝胶4B 亲和层析纯化方法，对重组蛋白进行纯化。通过粗酶液与beads 结合、杂蛋白漂洗、pp 酶切掉GST 标签、目的蛋白的纯化，得到纯度较高的目的蛋白。纯化后的目的蛋白在约37 kDa 处有一条明显条带。

2.2 ldh理化性质和亲水性/疏水性分析

使用ProtParam 工具分析ldh 酶氨基酸序列理化性质，在线预测结果见表1。使用ProtScale对ldh氨基酸序列进行亲水性/疏水性预测，结果见图3。

图3 ldh的亲水性/疏水性分析

表1 ldh氨基酸序列理化性质分析

通过ProtParam 的预测结果可知，CPB6-ldh 的氨基酸数为320 aa，分子量约为34.79 kDa，不稳定系数为27.28，小于40，表明ldh蛋白是较稳定蛋白，且脂肪系数较高，为92.06，推测ldh 是热稳定性蛋白。根据ProtScale 预测结果，Hphob./Kyte &Doolittle 量表规定疏水性越强的氨基酸标度值越高，当蛋白质的氨基酸标度值大于0 时为疏水，小于0 时为亲水。平均亲水系数为0.004 表明ldh 疏水性较高，这可能是由于ldh中丙氨酸（Ala）、亮氨酸（Leu）等疏水性氨基所占比例较高，在亲水性/疏水性分析中，ldh 氨基酸序列的第273 位缬氨酸（Val）的值为2.344，疏水性最强；第201 位赖氨酸（Lys）的值为-2.778，亲水性最强。

2.3 ldh的信号肽和跨膜区域预测

利用SignalP 5.0 server 对ldh 的氨基酸序列进行信号肽分析，分析结果见图4，表示氨基酸序列存在信号肽，可能性达到0.8645，且裂解位点在氨基酸序列29位和30位之间。

图4 ldh信号肽预测

利用在线工具TMHMM 2.0 Server 对ldh 的跨膜区进行分析和预测，结果见图5。在预测结果中，Inside 表示胞内区，Outside 表示胞外区，Transmembrane 表示跨膜区，数值越大表示可能性越大。因此可以看出ldh 为胞外酶，不存在跨膜结构域。

图5 ldh跨膜结构域预测

2.4 ldh二级结构与结构域分析

通过SOPMA 在线工具对ldh 的二级结构进行预测，结果见图6。蛋白的二级结构一般由α-螺旋、β-链、β-转角和无规则卷曲等结构原件组成。由图6 可以看出，ldh 的二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主，其中α-螺旋占43.12 %，无规则卷曲占27.5 %，此外，延伸链占21.56 %，β-转角占7.81 %。蛋白质的功能作用主要取决于蛋白质空间结构，其中α-螺旋主要是稳定其骨架，可起到跨膜传递的作用；蛋白酶的功能部位通常在无规则卷曲的构象区域。无规则卷曲可以使空间结构中的自由能达到最大，从而促进蛋白质的稳定性，预测结果中的无规则卷曲占比较多，说明ldh 可能具有较高的热稳定性。

图6 ldh二级结构（a）与结构域（b）分析

通过CDD和SMART工具对ldh的保守结构域分析。分析可知，ldh 具有高度保守的功能位点和结构域，ldh 特定匹配在L-2-羟基异丙酸脱氢酶（HicDH）亚家族，属于NADB-Rossmann超级家族，含有ldh-1-N 结构域（氨基酸序列第4～145 位）和ldh-1-C 结构域（氨基酸序列第148～315 位）。这两个结构域存在于代谢途径的许多脱氢酶中，如糖酵解过程和许多其他氧化还原酶。结构域中存在NAD结合位点的典型高度保守基序GXGXXG，使酶蛋白在辅酶NAD/NADH 的存在下才能催化乳酸和丙酮酸的可逆转化。

2.5 ldh蛋白质的三级结构预测及评价

使用SWISS-MODEL 工具对ldh 氨基酸序列进行同源建模，预测结果如图7（左）所示。根据结果显示，ldh 与3wsw.1（SMTL：ID）模板覆盖率为98%，同源性为30.57%。在预测到的三维结构中，红色表示α-螺旋，黄色表示β-折叠，绿色为无规则卷曲区域，总体来看，ldh 的三维结构以α-螺旋和无规则卷曲构象区域为主，预测结果与二级结构预测相符合。

使用在线软件SAVES 中的Verify_3D 以及拉氏构象图对模型进行评价。结果显示，ldh 的Verify_3D 评分为82.86 %。拉氏构象图简称拉氏图(Ramachandran Plot)，它的作用是体现氨基酸残基在拉氏图中的区域分布。拉氏构象图分为四个区，红色区域是最合适区域，其中的氨基酸数目越多表示该蛋白模型的骨架结构越合理；黄色区域是允许区域；浅黄色区域是最大允许区；白色区域是不允许区，该区域氨基酸的构象是不合理的。根据图7（右）可知，处于最合适区域的氨基酸残基占92.3%，不允许区占0.2%。

图7 ldh三维结构模型（左）与拉氏构象图（右）

2.6 重组ldh酶活测定

重组ldh 表达后经细胞破碎得到粗酶液，粗酶液经过琼脂糖凝胶4B 亲和纯化得到电泳级ldh。ldh 的分离纯化结果如表2 所示，最终重组ldh 的纯化倍数为14.29，比活力为29.365 U/mg。

表2 重组ldh比活力

2.7 重组ldh最适反应温度及温度稳定性

在20～60 ℃条件下测定了ldh 的酶活，由图8（a）可以看出，在20～60 ℃条件下ldh 均有酶活。在20～40 ℃低温范围内，随着温度的升高，酶活力不断增加，当温度达到40 ℃时，酶活性达到最高值；当温度大于40 ℃时，酶活呈不断下降的趋势，在60 ℃时，ldh酶活降到最低。

在15～75 ℃条件下测定了ldh 的温度热稳定性能力。结果如图8（b）所示，不同温度处理4 h后，只有15 ℃条件下ldh 相对酶活还能保持80 %以上，25 ℃和35 ℃条件下处理4 h 后还能保持在45%以上。从45 ℃水浴开始，随着时间延长，酶活大幅度下降，65 ℃和75 ℃处理影响最明显，在处理1 h 后相对活性就开始急剧下降，2 h 后完全失活。综合上述最适温度结果可知，ldh 耐高温能力较弱，即使高温下有酶活，但经过长时间处理后，也会导致酶失活。

图8 ldh的最适温度（a）和温度稳定性（b）

2.8 重组ldh最适反应pH值及其稳定性

在pH 5.0～8.0 条件下测定了ldh 的酶活。结果如图9（a）所示，在pH 值为6.0 和6.5 时，ldh 表现较大活性，且pH6.5时酶活性最高；在pH值低于5.5时酶活较低，pH 值高于7.0 时酶活性急剧下降，pH8.0时相对活性仅有21%左右。

在pH5.0～8.0 条件下测定了ldh 的耐酸碱稳定性，从图9（b）可以看出，在pH 6.5～7.5 的条件下处理4h 后ldh 相对活性仍然能保持在50 %以上；在pH 值为6.0 和8.0 条件下处理2 h 后相对活性也能保持在60 %左右，但随着时间延长相对活性也急剧下降；在pH5.0 条件下，4 h 后ldh 完全失活。由此可见，ldh在中性环境中有更好的pH值稳定性。

图9 ldh的最适pH（a）和pH稳定性（b）

2.9 金属离子和EDTA对ldh酶活的影响

金属离子能够对蛋白酶活产生一定的影响，以不添加任何金属离子的底物溶液作为空白对照，3 mM 不同金属离子的反应体系作为实验组。结果如图10 所示，添加Na对ldh 酶活有轻微促进作用；添加Mn和Co有较明显的促进作用；酶活提高了20%左右；添加Ca、Zn、Fe、Cu对ldh 酶活有较大的抑制作用，其中Fe的抑制作用最大，Mg的抑制作用相对较小，处理后的酶活能维持在85 %左右。汪勋清等研究发现，添加Ca和Zn后ldh 无明显变化，添加Mn后明显抑制了ldh 酶活，与本研究结果有差异，可能与ldh来源和结构不同有关，并且实验所添加的金属离子的浓度和ldh的纯度不同也会对结果产生影响。值得注意的是，本研究中Co对ldh 的活性促进作用最大，而重金属Co对大多数酶的活性都有抑制作用，猜测可能是Co与ldh 氨基酸残基结合而影响了ldh 活性中心，或类似碱性羧肽酶中Co代替Zn作为酶的辅助因子而促进了ldh活性。

图10 金属离子和EDTA对酶活的影响

添加金属螯合剂EDTA 对ldh 酶活的抑制作用很明显，EDTA 可以和一些金属离子形成稳定的络合物，酶的活性中心通常会有金属离子，与EDTA络合后酶的活性受到了抑制，因此金属离子对ldh酶活有重要影响。

3 结论

己酸可作为食用香料、动物饲料添加剂、天然抗菌剂和液体燃料的前体。随着对己酸需求的增加，微生物发酵产己酸的研究越来越受到重视。实验室保藏的瘤胃菌R1 具有将乳酸转化为己酸的功能，在其转化乳酸的过程中，乳酸脱氢酶开启了第一步反应。虽然各界学者对乳酸脱氢酶的研究已经非常透彻，但是关于瘤胃菌中乳酸脱氢酶的性质研究报道非常少。为了研究ldh在微生物利用乳酸产己酸的过程中的作用，通过分子层面提高乳酸转化的效率，本研究通过异源表达技术和酶学性质研究对ldh 进行了初步探索。以R1 基因组为模板，利用PCR 技术扩增出ldh 基因，经测序后用NCBI 数据库的BLAST 工具比对分析，与GenBank公布的瘤胃菌CPB6 的ldh 基因序列的同源性为99%，氨基酸序列的同源性为100%，说明ldh 基因在瘤胃菌中是非常保守的。本研究构建了pEGX 6p-1-ldh 重组质粒，并将其导入BL21(DE3)中实现了异源表达。经纯化后的重组ldh酶活达到29.365 U/mg，酶学性质测定结果显示，最适反应温度为45 ℃，最适反应pH 值为6.5，Na、Mn和Co对ldh酶活有促进作用，这对后续研究使ldh酶活达到最大化提供了理论依据。