超声波辅助酶法提取柚子皮果胶的工艺研究

李明依，迟雪文，季青霞，毕艳红，王小花，王朝宇，赵祥杰

（淮阴工学院 生命科学与食品工程学院，江苏淮安 223003）

0 引言

柚是桔属的3个基本种之一，以其营养丰富、耐储藏和易运输等特点，素有“天然罐头”之称。我国柚类种质资源的开发利用具有巨大的潜力，但目前柚子仅鲜食，少数被加工成产品，其消费量有限。且柚子皮占柚子重量的30%～50%，被当做废弃物直接丢弃，资源浪费严重且污染环境［1］。因此，研究柚子的深加工方法，既可以减少资源的浪费，又可以提高产品的附加值。

果胶是植物特有的细胞壁组织［2］，是一种天然的聚半乳糖醛酸高分子多糖物质［3-4］，也是膳食纤维的主要组成之一。因其良好的胶凝性和乳化稳定的作用，可作为胶凝剂、增稠剂、乳化剂和稳定剂等，在食品、医药和食品工业上有着广泛的应用［5-7］。另外，果胶还具有抗腹泻、抗癌和降血糖等多种作用，更是医药和化妆品工业不可缺少的辅料［8］。果胶提取的原料来源广泛，以西瓜、苹果皮、橘皮和葡萄皮等为主［9-10］，主要涉及酸提取法、酶解法、微波提取法和超声波提取法等［11-16］。

本文以柚子皮为原料，采用超声波辅助酶法对其中的果胶进行提取。在此基础上，采用响应面法对提取工艺进行优化［17］，为柚子皮的综合利用以及天然果胶的开发提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜柚子皮，从当地市场收集。

1.2 试验试剂

纤维素酶（山东枣庄杰诺生物酶制剂公司）；磷酸氢二钠、柠檬酸、无水乙醇、酚酞指示剂（国药集团化学试剂公司）；氢氧化钠（国药集团上海化学试剂公司）。所有试剂均为分析纯或生化试剂。

1.3 主要设备

DJ-10A型中药粉碎机（天津市中药机械厂）；GL-20B型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；GZX-GF-40X型电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）；HF-2.0B型超声波循环提取器（弘祥隆生物技术开发有限公司）；RE-520型旋转蒸发器（上海玻璃仪器二厂）；PHSJ-4A型pH计（上海精密科学仪器有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 试验工艺流程

新鲜柚子皮→灭酶→漂洗→干燥→粉碎→过筛（60目）→超声波辅助酶法提取果胶→离心作用→提取液浓缩→乙醇沉淀→过滤→干燥→粉碎→果胶

1.4.2 原料处理

清洗柚子皮，除去黄色外果皮，以白色中果皮为原料切成小块状，于沸水中预煮3～5 min，冷水冷却冲洗，沥干水分，在60 ℃下烘至恒重，粉碎成粉末状备用。

1.4.3 超声波辅助酶法提取果胶

称取5.0 g柚子皮粉于锥形瓶中，加入125 mL蒸馏水搅拌，加入一定量的酶，调节pH值和水浴温度，在90 W的超声波功率条件下酶解。将酶解液过滤，多次收集合并滤液得最终提取液。

1.4.4 乙醇沉淀法制备果胶

量取一定体积的柚子皮果胶浓缩提取液，加入提取液1.3倍体积的95%无水乙醇到柚子皮果胶提取液中搅拌，静置1 h后抽滤。将果胶沉淀置60 ℃烘箱中干燥，称重，计算柚子皮中果胶提取率。

1.4.5 单因素试验设计

（1）不同提取方法的比较。分别称取5.0 g干柚子皮粉于9个锥形瓶中，其中1，2，3号锥形瓶只采用超声波辅助法进行提取；4，5，6号锥形瓶只采用酶解法进行提取；7，8，9号锥形瓶采用超声波辅助酶解法进行提取。

（2）料液比对果胶提取率的影响。分别称取5.0 g干柚子皮粉，按料液比 1：15，1：20，1：25，1：30，1：35（g/mL）加入缓冲液调节pH值到4.5，在温度、加酶量和超声功率分别为40 ℃、2%（U/mL）和90 W的条件下提取50 min，比较不同料液比对果胶提取率的影响。

（3）时间对果胶提取率的影响。分别称取5.0 g干柚子皮粉，按料液比1：20（g/mL）加入缓冲液调节pH值到4.5，在温度、加酶量和超声功率分别为40 ℃、2%和90 W的条件下分别提取20，30，40，50，60 min，比较不同提取时间对果胶提取率的影响。

（4）加酶量对果胶提取率的影响。分别称取5.0 g干柚子皮粉，按料液比1：20加入缓冲液调节pH值到4.5，在温度为40 ℃，加酶量分别为0.5%，1.0%，1.5%，2%，2.5%（U/mL）和超声功率为90 W的条件下提取50 min，比较不同加酶量对果胶提取率的影响。

（5）pH值对果胶提取率的影响。分别称取5.0 g干柚子皮粉，按料液比1：20加入缓冲液分别调节pH 值为 3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，在温度、加酶量和超声功率分别为40 ℃、2%和90 W的条件下提取50 min，比较不同pH值对果胶提取率的影响。

（6）温度对果胶提取率的影响。分别称取5.0 g干柚子皮粉，按料液比1：20加入缓冲液调节pH值为 4.5，分别在温度为 30，35，40，45，50 ℃，加酶量为2%及超声功率90 W的条件下提取50 min，比较不同提取温度对果胶提取率的影响。

1.4.6 响应面法优化果胶提取工艺

根据单因素试验结果，采用Box-Behnken方法设计响应面试验［18］。选取料液比、pH值、加酶量和提取时间4个对果胶提取效果影响显著的因素，以果胶提取率为响应值，采用4因素3水平的响应面分析方法，确定最佳提取工艺参数，试验方案如表1所示。每组试验进行3次，果胶提取率取其平均值。数据采用SPSS 17.0软件进行处理，结果采用平均值±标准差表示。响应面组合试验运用Design-Expert.V 8.0.6软件。

表1 响应面试验因素水平表Tab.1 Table of factors and levels for response surface analysis

响应面试验采用29组完全设计，用来估计试验误差。优化结果将得出1个响应值（Y）与变量（X1、X2、X3、X4）间的二元多项回归模型：

式中 β0——常数；

Bi——一次项系数；

Bii——二次项系数；

Bij——交互作用系数；

k ——因素个数（k=4）。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法比较

超声波辅助法、酶解法及超声波辅助酶解法的比较结果见表2。由结果可知，在其他提取条件相同的情况下，超声波辅助酶解法提取柚子皮中果胶的提取率最高，并且操作简便，大大缩短了时间，环保高效。酶能高效温和地分解大分子物质［19-20］，且超声波的机械振动和空化作用能加速分子的振动和扩散，从而更有利于有效成分的溶出［21］。酶法提取过程中采用超声波协同处理可以充分利用这2种技术的优点，从而提高柚子皮果胶的提取率。

表2 不同提取方法对果胶提取率的影响Tab.2 Effects of different extraction methods on the pectin extraction ratio

2.2 超声波辅助酶法提取果胶的单因素试验结果

2.2.1 料液比对果胶提取率的影响

由图1可知，料液比小不利于柚子皮果胶的溶出，提取率较低；随着料液比的增大，果胶易转移到提取液中，从而增加果胶提取率。当料液比为1：30时，果胶提取率达到最大；料液比继续增加，果胶提取率反而降低，可能是由于此时提取体积过大，纤维素酶作用的底物浓度显著降低的原因；此外，料液比过大，乙醇沉淀过程中果胶损失也增大［22］，且乙醇的消耗量多也会造成生产成本过高。因此，料液比选择1：30为宜。

图1 料液比对果胶提取率的影响Fig.1 Effects of material-to-liquid ratio on the pectin extraction ratio

2.2.2 时间对果胶提取率的影响

酶解反应需要酶与底物的充分相互作用，时间太短酶促反应不完全，时间太长不利于生产。由图2可以看出，果胶提取率先随时间的增加而迅速上升，当酶解时间为50 min时，果胶提取率达到最大峰值，为23.80%，之后提取率有所下降。这可能是由于超声波的机械振动和空化作用等影响，使分子振动加快，极大地促进酶解反应速度，提高了酶促反应效率；而当处理时间较长时，超声波的空化作用将某些大分子物质破坏成小分子物质，造成提取率有所下降。因此，超声波辅助酶解法的最佳处理时间选择50 min。

图2 提取时间对果胶提取率的影响Fig.2 Effects of extraction time on the pectin extraction ratio

2.2.3 加酶量对果胶提取率的影响

从图3可以看出，当纤维素酶的添加量小于2%时，随着酶添加量的增大，柚子皮果胶的提取率也不断增大，这可能是由于柚子皮被纤维素酶不断破坏，使得更多果胶溶出。当加酶量超过2%时，继续添加纤维素酶，果胶提取率并未增加，这可能是由于底物已经同酶完全结合，继续加大酶量反而浪费。综合考虑，最终选取2%的纤维素酶添加量。

图3 加酶量对果胶提取率的影响Fig.3 Effects of amount of enzyme on the pectin extraction ratio

2.2.4 pH值对果胶提取率的影响

图4显示，pH值在4.5时果胶的提取率最高，达24.69%，表明在此处酶的活性最大。pH值增大或者减小，都会使纤维素酶远离最适pH值，造成酶活性的降低，从而导致果胶提取率的降低。因此酶的最适pH值为4.5。

图4 pH值对果胶提取率的影响Fig.4 Effects of pH value on the pectin extraction ratio

2.2.5 温度对果胶提取率的影响

由图5可以看出，温度对果胶提取率的影响较大，主要原因有2个：一是温度的升高能够增强果胶溶出的传质动力；二是酶有最适的作用温度。在温度低于40 ℃时，随着温度的升高，果胶提取率逐渐增大；而当温度高于40 ℃时，随着温度的升高，果胶提取率又呈现下降的趋势。因此提取温度选择40 ℃。

图5 温度对果胶提取率的影响Fig.5 Effects of temperature on the pectin extraction ratio

2.3 响应面法优化果胶提取工艺研究

2.3.1 试验设计与结果

采用Box-Behnken设计方案，对方差分析所筛选出的 4 个因素进行编码，X1、X2、X3、X4分别为料液比、提取pH值、加酶量和提取时间，以果胶提取率为响应值进行检验。响应面试验采用29组完全设计，其中包括24个析因试验和5个中心点试验，用来估计试验误差。

2.3.2 回归方程的建立及统计分析

用方差分析的F检验对回归模型进行统计分析，结果列于表3。

表3 回归方程系数及显著性检验Tab.3 Regression equation coefficients and significant test

以果胶的提取率为响应值，经回归拟合后，各因子对响应值的影响可用以下回归方程表示：

模型的F值为27.81，显著性分析得P﹤0.001，说明所得的回归模型对果胶的提取率有很好的预测性。失拟项F值为0.15，P>0.05，差异不显著，说明该回归方程对试验拟合情况良好，未知因素对试验结果干扰性小，说明残差均由随机误差引起［23］。同时，表3中的各项方差分析表明，X1、X2、X3、X4、X12、X22、X32、X42项（P<0.05）对果胶提取率的影响显著。模型显示，相关系数R2（0.965 3）与调整的相关系数Adj-R2（0.930 6）都接近1，说明测定值与预测值之间有极高的拟合度［24］。

综上所述，该回归方程为优化超声辅助酶法提取果胶的工艺提供了良好的模型。

2.3.3 响应面分析及提取工艺优化

图6直观反映了料液比、pH值、加酶量和提取时间之间的交互作用对响应值的影响。发现响应面开口方向向下，随着因素的增大，其响应值增大；当响应值达到极值以后，随着因素的增大，响应值则逐渐减小。说明该模型有稳定点，且稳定点是交互作用的最大值。从图中还看出，各因素之间的交互作用均呈现先上升后下降的抛物线形关系，说明两两交互均对柚子皮果胶提取率有较大的影响；且等高线是椭圆形的，也表明2者之间的交互作用明显［25-27］。

图6 不同因素对果胶提取率的影响Fig.6 Effects of different factors on pectin extraction ratio

2.4 模型验证

通过响应面软件对试验参数进行优化，得到柚子皮果胶提取率的最佳工艺条件：料液比1：26.30，pH 值 4.65，加酶量 1.87% 和提取时间47.49 min。在提取温度40 ℃下，柚子皮果胶提取率达到24.81%。为考察模型的可靠性和准确性，随机抽取3组试验组合与最优试验组合，进行实测值和预测值之间的吻合度对比，结果见表4。果胶提取率的实测值与预测值非常吻合，说明试验得到的模型有效并可靠。在最优条件下，果胶提取率的实测值为24.81%，是随机组1提取率的1.46倍。

表4 验证试验设计与结果Tab.4 Design and test results of confirmatory experiment

3 结语

试验通过研究料液比、pH值、加酶量、提取时间和提取温度对柚子皮果胶提取率的影响，从5个单因素中选取影响较为显著的4个因素，进行4因素3水平的响应面试验，通过响应面优化得到的柚子皮果胶提取率的最佳工艺条件：料液比 1：26.30，pH 值 4.65，加酶量 1.87%，提取温度40 ℃和提取时间47.49 min。在此条件下，柚子皮果胶提取率达到24.81%，与模型的预测值基本一致。