白芨不同制品的多糖含量及止血作用研究

李雪营，林先燕，许义红，魏学军，张彬润

(黔南民族医学高等专科学校，贵州都匀558013)

白芨(BletillastriataReichb)是多年生草本植物白芨的干燥块茎，主要分布在贵州、广西、四川等地，具有消肿止血、敛疮生肌的功效，临床上常用于咳血、外伤出血、疮疡肿毒等症候治疗[1]。白芨作为传统止血药，现有研究表明，白芨多糖是白芨止血作用的活性成分[2]。中药炮制是控制药材品质、抑制偏性、增强药效和保障临床用药安全的技术手段，而目前有关炮制对白芨药效影响的研究报道较少。本研究旨在考察炮制对其止血作用和活性成分白芨多糖含量的影响，选择炒黄、炒焦和炒炭等炮制方法来开展研究，以探讨白芨止血的适宜炮制方法及与活性成分白芨多糖含量的相关性。

1 仪器与器材

1.1 仪器 Agilent1260Infinity 型高效液相色谱仪(北京安捷伦公司)；MU5100DUVF型反渗透超纯水机(北京众力)；FS-1200N型超声波处理器(杭州汇尔公司)；奥豪斯DV215型分析天平(上海精科天美)；RV10型旋转蒸发仪(德国IKA艾卡)。

1.2 材料 炮制所需白芨鲜品采自校内植物园试验地，经本校中药教研室李香教授鉴定为兰科植物BletillastriataReichb的干燥块茎。D-无水葡萄糖购于中国食品药品检定研究院(批号：110833-201806)，SPF级昆明种小鼠购于长沙市天勤生物科技有限公司[许可证SCXK(湘)2014-0011]，水为纯化水，其他试剂均为AR级。

2 方法与结果

2.1 样品的制备 将新鲜白芨块茎洗净，加工制成片状。取100 g生品，按《中国药典》2015年版中附录炮制通则单炒项下的要求，用文火(锅底温度约100℃)炒至原色加深，取出，放凉即得炒黄品。取100 g生品，按《中国药典》2015年版中附录炮制通则单炒项下的要求，用中火(锅底温度约为150℃)炒至表面焦褐色，取出，放凉即得炒焦品。取100 g生品，按《中国药典》2015年版中附录炮制通则炒炭项下要求，用武火(锅底温度约200℃)炒至白面焦黑色，取出，放凉即得炒炭品。

2.2 白芨多糖的测定

2.2.1 供试品溶液的制备[3]分别精密称取不同制品白芨药材粉末2 g，至具塞锥形瓶中，采用超声提取法咋料液比1∶30、温度0℃、时间30 min的条件下提取，提取液经真空抽滤，离心，浓缩后用水稀释定容至50 ml，摇匀，备用。

2.2.2 标准葡萄糖溶液的制备 精密称取干燥至恒重的D-无水葡萄糖对照品20.0 mg置于50 ml容量瓶中，加适量纯化水溶解并定容至刻度，配置成100 mg/L的溶液。分别精密量取上述溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml至于10 ml容量瓶中，用纯化水稀释至刻度，配制成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/ml的标准葡萄糖溶液。

2.2.3 标准曲线的绘制 分别精密量取上述标准葡糖糖溶液2.0 ml置于不同的20 ml具塞刻度试管，分别加入新制5%苯酚溶液1.0 ml，浓硫酸5.0 ml，加纯化水至总体积为10 ml，振匀，静置5 min后，水浴加热15 min，补充减失的水分至刻度后混匀，再置于冷水浴中静置10 min。以纯化水为空白对照，于490 nm波长处测定吸光度。以葡糖糖质量浓度为横坐标X，以吸光度为纵坐标Y，绘制标准曲线，得回归方程Y=1.02X+0.022 2(R2=0.999 6)。试验结果表明在10～50 μg/ml范围内对照品溶液质量浓度具有良好线性。

2.2.4 精密度考察 分别精密量取对照品溶液6份，按“2.2.3”项下方法连续测定6次吸光度，吸光度RSD值为1.19%。

2.2.5 稳定性考察 分别精密量取对照品溶液6份，按“2.2.3”项下方法，分别在1、2、4、6、8、12、24 h连续测定6次吸光度，RSD值为1.72%。

2.2.6 重复性试验 精密称取炒黄品5份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项下方法测定吸光度，RSD值为1.65%.

2.2.7 加样回收率试验 精密称取已知白芨多糖含量的炒黄品5份，加入适量D-无水葡萄糖对照品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项下方法测定吸光度，葡糖糖平均回收率为97.75%，RSD值为1.87%。

2.2.8 含量测定 精密量取各不同炮制品提取所得供试品溶液2.0 ml，按“2.2.3”项下方法测定吸光度并计算多糖含量，测得值为3批次的均值。结果见表1。

表1 不同制品中白芨多糖含量比较

2.3 小鼠出、凝血时间测定[4]用生理盐水作为空白溶液，取1.3 g云南白药粉末，加入100 ml纯化水即得阳性药物溶液。称取不同制品白芨粉末各20 g，用超声提取法提取，料液比1∶20，温度80℃，时间10 min。过滤、离心后减压回首乙醇至近干，加纯化水定容至20 ml容量瓶中，即得含原药材为1 g/ml的个样品溶液。取60只小鼠，随机分成6组，分别ig给予各样品溶液、云南白药和生理盐水，给药体积为20 g/ml，1次/d，连续ig 5 d。末次给药1 h后用手术剪距小鼠尾尖0.5 cm处剪断，待血液自行溢出时开始计时，每隔30 s用吸水纸蘸血滴1次，直至截面无血液渗出(用吸水纸蘸时无血迹)计时停止，耗时记为出血时间(BT)。另取60只小鼠，分组与给药剂量同上。末次给药1 h后，用毛细管于小鼠眼球后静脉丛取血，待血液充满玻璃管时开始计时，每隔30 s折断玻璃管约0.5 cm，并向两侧缓慢拉开，观察这段出有无血凝丝出现，至血凝丝出现为止，耗时记为小鼠凝血时间(CT)。结果见表2。

表2 白芨不同制品出、凝血时间比较

3 讨论

研究结果表明，不同炮制加工方法对白芨多糖含量的影响显著。统计分析结果显示，与生品比较，采用炒黄炮制加工方法制备的炒黄品能显著提升多糖含量(P<0.05)，而炒焦品和炒碳品多糖含量显著降低(P<0.05)，尤以炒炭品最低。究其原因，可能与炒黄品炮制温度适宜，增加了组织的疏松性有利于多糖的煎出[5]；而随着炮制温度的升高，多糖部分分解为还原糖[6]或部分碳化，导致炒焦品和炒碳品中多糖下降明显。

在止血作用的动物试验结果中，白芨炒黄品、炒焦品和炒炭品均较生品的止血作用强(P<0.05)，尤以炒炭品最显著。该结果提示，采用适宜的炮制加工方法能显著增强白芨的止血作用。结合制品多糖含量的测定结果来看，白芨炒炭品能增强止血作用与白芨多糖含量无相关性，其止血作用增强的原因可能与非白芨多糖成分或炒碳过程中其他物质的产生有关，如炭素和Ca2+的形成等[7]。因此，需对白芨炒碳制品增强止血作用的物质基础作进一步研究。