胃食管反流病伴焦虑抑郁身心共病肠道菌群分析

韩士举,林 强,孟宪博,赵亚刚,王景杰

(空军军医大学大学第二医院消化内科,西安 710038;*通讯作者,E-mail:jingjiefmmu@163.com)

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)是指胃、十二指肠内容物逆流进入食管引发的以烧心、反流为典型症状的慢性疾病,同时可伴有胸痛、咽喉不适、哮喘及咳嗽等食管外症状,依内镜下表现主要分为反流性食管炎(reflux esophagitis,RE)和非腐蚀性反流性疾病(nonerosive reflux disease,NERD)两种表型[1],GERD在世界范围内广泛流行,我国人群的GERD患病率高达7.69%[2],该病症状易反复发作,不仅影响患者的身心健康和生活质量,给社会也带来巨大的经济和医疗负担,其治疗是目前临床工作的难点和挑战。目前虽然其治疗手段多样,但“质子泵抑制剂治疗无效”及“心身共病”这两大难治性GERD的诊疗难题仍未得到有效解决,临床上对GERD伴发精神心理障碍患者的处置尤为棘手。有研究发现对GERD与精神心理障碍心身共病的患者进行质子泵抑制剂及抗反流手术治疗,患者症状缓解并不明显,即使加用抗焦虑抑郁等精神类药品只能减轻患者精神症状而加重反流症状[3]。近年来的研究发现肠道菌群在GERD和精神心理障碍发病中分别发挥着重要作用[4,5],然而GERD与精神心理障碍身心共病患者肠道菌群改变情况目前尚不清楚,本研究旨在探讨GERD伴焦虑抑郁身心共病患者肠道菌群改变情况,为GERD与精神心理障碍心身共病的患者寻找有效治疗手段提供一定参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2021年1月至2021年10月在空军军医大学第二附属医院消化科内镜中心诊断为GERD的58例患者,包括GERD伴焦虑抑郁患者27例以及GERD不伴焦虑抑郁患者31例,同期随机选取健康体检中心40例健康志愿者,收集并整理患者的基本信息如吸烟史、饮酒史、家族史等,并根据诊断标准分为:正常对照(NC)组、GERD不伴焦虑抑郁(GNAD)组、GERD伴焦虑抑郁(GAD)组。

1.2 纳入排除标准

GERD患者纳入标准:①年龄18～70岁之间;②内镜明确诊断为反流性食管炎患者;内镜阴性,但经24 h动态反流监测诊断为GERD患者;③近2周内未服用PPI、抗生素、益生元或益生菌等;④签署知情同意书并同意取粪便进行菌群分析;⑤依据焦虑自评表(SAS)及抑郁自评量表(SDS)的测评结果将GERD患者分别分入GAD及GNAD两组。

正常对照组纳入标准:①健康体检中心提供年龄在18～70岁之间无器质性疾病人群,经过内镜检查无反流性食管炎,GredQ评分<8分,SAS、SDS评分量表诊断无焦虑或抑郁;②近2周内未服用PPI、抗生素、益生元或益生菌等;③愿意提供粪便样本进行菌群分析。

排除标准:①全身疾病史,例如肝硬化、肾衰竭和恶性肿瘤;②相关检查除外胃肠道器质性病变;③无法完成问卷调查或者其他相关检查患者排除在外。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 利用小匙取1 g大便样本装至1.8 ml冻存管,获取新鲜样本后2～6 h内冰袋转运至我院消化内科实验室-80 ℃冰箱保存备用。

二代测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接,区分样本后对序列质量进行质控和过滤,然后进行操作分类单元(operational taxonomic units, OTUs)聚类分析和物种分类学分析。

1.3.2 粪便菌群DNA提取 使用OMEGA试剂盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取粪便总DNA,琼脂糖凝胶检测DNA完整性, Qubit定量检测DNA样本浓度。

1.3.3 16S rRNA PCR扩增、Illumina测序及文库质控 对质检合格的DNA使用Nobar-341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)及Nobar-805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)正反测序引物,PCR扩增细菌16S rRNA的V3和V4区。

通过2%琼脂糖凝胶电泳检测文库大小获得点样顺序,使用Qubit3.0荧光定量仪进行文库浓度测定得到均匀的长簇效果和高质量的测序数据。本研究基于Illumina MiSeq PE300平台进行上机测序。采用PANDAseq软件通过重叠关系进行拼接,获得高变区的长reads(序列)。

2 结果

2.1 一般临床资料

共27例GAD患者、31例GNAD患者和40例NC入选本研究。27例GAD者中,RE患者17例,NERD患者10例;31例GNAD患者中,RE患者22例,NERD患者9例。在基线比较中,三组人员的性别构成比、年龄及体质量指数(body mass index, BMI)等差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。

2.2 粪便菌群总体特征分析

2.2.1 OTU数目 本研究共得到493个OTUs,基于不同样本和不同组之间的OTUs数目绘制Venn图(见图1),GAD组、GNAD和NC组的OTUs数目分别为453个、402个及419个,共有的OTUs数目为351个;Observed OTU指数代表菌群中的OTU丰度大于0物种数之和,三组之间的Observed OTU指数差异无统计学意义(P=0.3,见图2),表明三组在OTU多样性比较上差异无统计学意义。

表1 GAD、GNAD及NC三组研究对象之间的基线值比较

图1 GAD、GNAD及NC三组OTUs数目Venn图Figure 1 Venn diagram of OTUs in GAD, GNAD and NC groups

图2 GAD、GNAD及NC三组之间的OTU多样性比较Figure 2 Comparison of OTU diversity among GAD, GNAD and NC groups

2.2.2 粪便相关菌群物种注释分析 本研究根据物种注释结果分别在门、纲、目、科、属水平确定了粪便细菌群落相对丰度排名。其中在门水平,排名靠前的是厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门及其他;在纲水平,物种丰度较高的是梭菌纲、γ-变形菌纲、放线菌纲、厚壁菌纲;在目水平,梭菌目、肠杆菌目、双歧杆菌目、乳杆菌目在三组的丰度均靠前;在科水平,丰度较高的包括瘤胃菌科、肠杆菌科、双歧杆菌科、毛螺旋菌科、丹毒丝菌科、拟杆菌科、链球菌科、明串珠菌科、乳杆菌科、红蝽杆菌科、消化链球菌科、巴斯德菌科、普氏菌科;在属层面上,芽殖菌属、双歧杆菌属、粪杆菌属、拟杆菌属、链球菌属、罗斯氏菌属、柯林斯氏菌属、小球菌属等占优势(见图3)。

2.3 组间Alpha多样性分析

采用ANOVA方差分析检验三组肠道菌群的Alpha多样性指数差异,丰富度用chao指数表示,多样性则采用香浓(Shannon)指数和辛普森(Simpson)指数2个指标表示,样本文库覆盖率用测序深度(Coverage)指数表示。最终结果显示,三组之间的chao指数、Shannon指数、Simpson指数、Coverage指数差异无统计学意义(P=0.21,0.64,0.82,0.61,见图4)。

2.4 组间物种差异性分析

利用Welch’st检验对不同组在不同水平的肠道菌群丰度进行两两比较时发现,在科水平GAD组的莫拉氏菌科及Incertae-Sedis-ⅩⅢ科的相对丰度水平高于NC组,差异有统计学意义(P<0.05);在属水平GAD组的不动杆菌属、沉积物杆菌属、木杆菌属、根瘤菌属、毛绒厌氧杆菌属相对丰度高于NC组(P<0.05),GAD组的毛绒厌氧杆菌属的丰度高于GNAD组(P<0.05);GNAD组厚壁菌门的相对丰度低于NC组,差异有统计学意义(P<0.05,见图5)。

2.5 组间的LEfSe分析

本研究通过LEfSe检验确定了对GNAD组贡献显著的5个OTU及4个不同水平的细菌物种(LEfSe检验,均P<0.05,见图6),设定线性判别分析(linear discriminant analysis,LDA)阈值为2,评估差异显著的物种的影响力,分值从高到低依次为链球菌科、链球菌属、欧陆森氏菌属、霍尔德曼氏菌属(见图7)。

图3 三组菌群在门、纲、目、科、属分类水平构成及丰度值Figure 3 Relative abundance of species at phylum, class, order, family and genus levels in each group

图4 GAD、GNAD及NC三组菌群Alpha多样性比较Figure 4 Comparison of Alpha diversity of bacteria between three groups

与NC组比较，*P<0.05;与GAD组比较，#P<0.05图5 不同分类水平的菌种差异比较Figure 5 Comparison of different levels between groups

图6 三组之间粪便菌群LEfSe分析Figure 6 The LEfSe analysis of intestinal flora between three groups

图7 GAD组肠道菌群LDA评分Figure 7 LDA score of the intestinal flora in GAD patients

3 讨论

众所周知,肠道是人体最大的细菌库,菌群紊乱不仅能导致消化系统疾病的发生,还可通过脑-肠轴与宿主进行互动,影响宿主大脑功能和行为,在焦虑抑郁等精神心理障碍的发病中起到重要作用。菌群失调影响GERD的机制可能包括:①以革兰氏阴性菌为代表的肠道内的部分微生物细菌可以产生大量脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活Toll样受体-4(Toll-like receptor 4,TLR-4),诱导白介素(interleukin,IL)18的产生,继而启动IL和肿瘤坏死因子的级联反应,促进炎症的发生并导致内脏高敏[4];②另一方面肠道菌群产生的脂多糖还可通过激活核因子-κB(NF-κB)信号通路促进环氧化酶-2(COX-2)生成延迟胃排空,激活Toll样受体信号通路上调诱导型一氧化氮合酶的表达增加一氧化氮合成使食管下括约肌松弛[6],肠道微生态紊乱在焦虑抑郁等精神心理障碍的发生发展也发挥了重要作用,肠道菌群借助其代谢产物、炎症因子、神经递质、各类激素通过下丘脑-垂体-肾上腺轴、迷走神经、血液系统与大脑相应功能核团互动,影响中枢系统对情感的处理,进而导致焦虑抑郁的发生[7,8]。既往研究也证实GERD及精神心理障碍患者的消化道微生物组成与健康人群相比确实发生较大改变,在对GERD患者的菌群分析中,菌群的研究范围从口腔、食管延续至肠道,结果均显示与GERD患者的消化道菌群与健康人群的菌群存在显著差异[9-11],而在精神心理障碍患者的菌群分析中,研究发现无论焦虑、抑郁、双向情感障碍还是精神分裂症患者与正常人相比肠道菌群均发生不同层次改变[12-14]。随着人们肠道微生态生理学研究的深入,对这两类疾病患者肠道菌群针对性治疗也取得显著效果[15,16]。然而针对GERD与精神心理障碍身心共病患者的菌群改变情况的研究目前未见相关报道,因此我们设计了本次研究,纳入了GERD伴焦虑抑郁、GERD不伴焦虑抑郁及健康人群三类人群进行粪便菌群的16SrDNA高通量测序分析,探索GERD与精神心理障碍心神共病患者相对于其他两组人员肠道菌群的变化特征,以期为基于肠道微生态的益生菌、益生元及菌群移植治疗提供一定思路。

在Alpha多样性比较上,本研究结果显示GERD伴焦虑、抑郁人群与GERD不伴焦虑、抑郁以及健康人群菌群之间的Alpha多样性无差异。在目前关于焦虑抑郁患者肠道微生物群变化情况的研究中大多数病例对照实验的结果显示焦虑抑郁患者与健康对照人群相比Alpha多样性无差异[17],GERD患者相对于健康人群的Alpha多样性则倾向于降低[18],本研究纳入的三组人群的Alpha多样性无差异,与目前单纯焦虑抑郁患者的菌群多样性的研究结果吻合程度更高。

在具体的物种丰度分析时,本文发现在科水平GERD伴焦虑抑郁组相对于正常人群组的莫拉氏菌及梭状芽孢杆菌ⅩⅢ丰度明显升高,在属水平GERD伴焦虑抑郁患者的的不动杆菌属、沉积物杆菌属、木杆菌属、根瘤菌属、毛绒厌氧杆菌属与正常人群相比丰度明显升高,Jiang等[19]在探索焦虑症患者肠道菌群变化时发现焦虑症患者与健康人相比拟杆菌门、梭杆菌门、粪杆菌属、直肠真杆菌属、毛螺菌属、酪酸球菌属的丰度升高,Naseribafrouei等[20]发现抑郁症患者相对于健康人群肠道微生物中的颤螺菌属和产丁酸菌属的丰度升高,而Chung等[21]的研究发现抑郁症患者的双歧杆菌属和布氏杆菌属的丰度升高,普氏杆菌属的丰度降低,本次研究结果与既往研究相比,虽然在具体的菌种存在差异,但总体增加的均为革兰氏阴性杆菌类。本实验发现,GERD伴与不伴焦虑抑郁患者在毛绒厌氧杆菌属的丰度上存在明显差异,这个发现目前尚未有报道研究。此外在GERD不伴焦虑、抑郁与健康人群比较时,我们发现GERD患者人群厚壁菌门的丰度明显下降,这也与之前报道的研究结果相吻合[11]。总体来看,与既往研究相比，研究中GERD伴发焦虑、抑郁患者菌种丰度的改变趋势更接近于单纯焦虑抑郁患者的菌种丰度改变趋势,特别是本实验GAD组中27例患者中伴焦虑患者19例,占多数,因而菌种丰度分析结果倾向于既往对焦虑症患者的菌群分析结果。

而在三组菌群LEfSe分析中,我们最终确定了链球菌科、链球菌属、欧陆森氏菌属、霍尔德曼氏菌属与GERD伴焦虑、抑郁密切相关,作者认为一方面这4类菌种可能确实参与了GERD伴焦虑、抑郁身心共病的发病,Zaidi等[22]在GERD的大鼠模型消化道中检测到高丰度的链球菌,Nicolini等[23]发现早发性精神障碍患者血清中的抗链球菌抗体明显高于正常人,Cengel-Kultur等[24]也报道了链球菌感染与精神症状之间存在关联,Barandouzi等[25]在抑郁症患者中发现欧陆森氏菌属丰度的升高,Chen等[26]研究发现霍尔德曼氏菌属的丰度与焦虑、抑郁呈正相关。但另一方面也不排除该结果为患者长期服用PPIs类药物所致,由于GERD伴发精神心理障碍患者通常症状反复且难治,因此患者需长时间反复服用PPIs类药物来缓解不适,Shi等[27]的研究发现长期使用PPIs会导致肠道内链球菌科、韦荣氏球菌科等丰度明显升高,这与本实验最终结果存在一定程度的吻合,尽管本试验纳入的GERD伴焦虑抑郁患者短期内未服用PPIs,但在访谈中均有长期反复服用该类药物史,因此PPIs仍对本实验的结果存在一定程度的干扰。

综上所述,链球菌科、链球菌属、欧陆森氏菌属、霍尔德曼氏菌属可能参与GERD伴焦虑、抑郁的发生发展,在临床上有望通过调节肠道菌群来预防和治疗该病。但本研究属于横断面研究,难以得出肠道菌群变化与GERD伴焦虑、抑郁的因果关系,且样本量较小,可能存在偏倚,需要大样本、前瞻性研究进一步验证。