二代基因测序技术在胃癌病理临床分析中的应用价值

聂尊珍,郭 英

(西安大兴医院病理科,西安 710082;*通讯作者,E-mail:yingguo2nd@aliyun.com)

胃癌是发病率居世界第5位,死亡率居世界第3位的最常见的恶性肿瘤[1,2]。随着胃癌早期诊断和治疗水平的逐步提高,胃癌的发病率和死亡率呈现下降的趋势[3]。部分胃癌具有遗传背景,约10%的胃癌患者具有家族聚集特征,胃腺癌家族史与胃腺癌发生的危险度为3.8(95% CI 1.5～9.7)[4]。弥漫型胃癌和印戒细胞型胃癌,发生CDH1基因突变与胃癌发病风险高有关[5],都与胃癌的分子分型密切相关。胃癌分子分型是实行靶向治疗的重要前提。然而目前病理组织形态学诊断、免疫组织化学染色等传统病理诊断方法,已经不能满足胃癌临床靶向治疗的需求,具有很大局限性。NGS的广泛应用为胃癌基因组的研究开启了新的视角,可以从基因组层面深入地揭示肿瘤发生、发展、转移的原因,进而为肿瘤的早期诊断、个性化治疗及预后评估提供有力的理论支撑。因此,如何通过NGS检测分析、解读胃癌的病理临床特征和高频突变基因具有重要意义。本研究对收集15例胃癌患者从组织形态学、免疫组化表型、分子分型等方面深入研究,以期寻找到与胃癌增殖、转移相关的高频突变基因,为临床诊治提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取西安大兴医院医院病理科2019—2020年术前均未经治疗的手术切除胃腺癌样本15例。其中男性12例,女性3例,平均年龄65岁,临床分期1～2期4例,临床分期3～4期11例,9例发生淋巴结转移,6例未发生淋巴结转移。所有切片均由两位主治以上医师阅片。

1.2 实验方法

1.2.1 常规HE染色及免疫组化染色方法 15例标本经10%中性甲醛固定,常规脱水,石蜡包埋切片,4 μm厚度连续切片,HE染色和免疫组织化学辣根过氧化物酶偶联的酶标免疫染色法,检测指标包括:MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、HER-2。免疫组织化学染色由Ventana Benchmark XT全自动染色仪完成。

一抗试剂:MLH1(克隆号:521I4D5),MSH2(克隆号:644G5A4),MSH6(克隆号:8212G2C1),PMS2(克隆号:157G1F5),HER-2(克隆号:246G0D3),以上抗体购自苏州百道医疗科技有限公司。

1.2.2 二代基因测序技术(NGS) 样本DNA提取和处理,测序文库构建,探针富集,基因高通量测序,捕获后的文库按照OseqTM-T肺癌个体化诊疗基因检测文库构建试剂盒,提供突变类型状态的评估,共涵盖了17种癌种,779个外显子区域,检测突变类型包含单核苷酸变异、插入缺失、拷贝数变异等。首先将DNA在试剂盒的作用下形成DNA簇,然后向反应体系中加入DNA聚合酶,接头引物,特异性荧光标记的dNTP,使用联合探针锚定聚合测序法,在HiSeq3000测序平台上样,测序平台通过单个碱基合成后洗脱游离的dNTP和DNA聚合酶,之后进行荧光检测,计算机分析将光学信号转化为测序碱基,以达到测序的目的。加入试剂中和荧光信号,继续下一轮测序反应。

1.3 免疫组化结果判读

1.3.1 MMR蛋白的免疫组化表达判读 至少1种MMR蛋白(MLH1, MSH2, MSH6, PMS2)在肿瘤细胞中完全丧失核反应性,但在背景非肿瘤细胞中保持核染色,我们将其作为微卫星不稳定(MSI);当肿瘤细胞显示所有4种MMR蛋白的核免疫染色完整时,判断肿瘤为微卫星稳定(MSS);4个标记物中有2个或2个以上不稳定的肿瘤被定义为高度微卫星不稳定(MSI-H),而只有一个标记物不稳定的肿瘤被归类为低度微卫星不稳定(MSI-L)。

1.3.2 HER2免疫组化判读 0(阴性):细胞膜无着色,或仅有细胞质着色;1+(弱阳性):任何比例细胞呈现微弱、不完整膜着色;2+(阳性):>10%的细胞呈现弱至中等强度、完整但不均匀膜棕黄着色或<30%的细胞呈现完整膜强的棕褐着色;3+(强阳性):>30%的细胞呈现完整膜强的棕褐着色[6]。

1.4 胃癌的分子分型

癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)将胃癌分为染色体不稳定型(CIN)、遗传稳定型(GS)、微卫星不稳定型(MSI)和EBV感染型(EBV)4个分子亚型[7]。MSI和EBV亚型对免疫治疗反应好。CIN亚型多见于肠型胃癌,并伴有EGFR、VEGFA、CCNE1、CCND1、CDK6基因突变,可占胃癌总突变的50%。GS亚型与弥漫型胃癌发生相关,常伴有RHOA、CLDN18基因突变,占总突变的19%。EBV亚型常伴有PIK3CA、PDL1/PDL2突变,占总突变类型的10%;MSI型常伴有MLH1、PIK3CA、EGFR突变和PDL1过表达,占总突变类型的19%。EBV、MSI亚型PDL1免疫疗法疗效显著[8]。

1.5 随访

本研究病例资料信息得到患者的知情同意,随访信息通过电话获得,从手术切除确诊后开始,截止时间2021年9月,患者死亡,随访截止。

2 结果

2.1 临床资料

15例胃腺癌患者的临床病例特征及随访情况见表1。15例胃腺癌患者病理分期:T1期4例(27%),T3期4例(27%),T4期7例(46%);组织学分型:低分化腺癌10例(67%),中分化腺癌患者5例(33%);lauren分型:肠型8例(53%),弥漫型7例(47%)。微卫星稳定表型分型:MSI型1例(6.7%),MSS型14例(93.3%)。胃癌分子分型:CIN型7例(47%),MSI型1例(6%),EBV型3例(20%),GS型4例(27%)。病例12:发生微卫星不稳定,体细胞突变个数最多(n=31),同时TMB值最高(TMB=51.61);病例4:体细胞突变个数最少(n=3),TMB值最低(TMB<0.1)。共6例患者接受了化疗,5例低分化腺癌,1例中分化腺癌,其中4例获得无病生存,2例死亡(病例3化疗1疗程后因为多发转移死亡,病例15因并发肺腺癌治疗无效死亡)(见表1)。

表1 15例胃腺癌患者病理、分子临床特征及随访信息

2.2 具有胃癌遗传特征患者的病理组织学及免疫组化表达特征

①病例2:低分化腺癌,lauren分型为弥漫型,癌细胞呈片状、巢状弥漫浸润性生长,胞浆嗜酸,胞核嗜碱;癌细胞周围可见大量淋巴细胞浸润,局部可见小灶癌巢周围存在收缩裂隙;分子分型为CIN型(见图1A)。

②病例12:中分化腺癌,lauren分型为肠型,瘤细胞呈腺状分布,腔内可见组织细胞分布,间质内淋巴细胞浸润(见图1B);分子分型为MSI型,免疫组化表型显示MLH1、MSH2、MSH6表达阳性,PMS2表达缺失(见图1C-F),同时HER-2高表达(3+)(见图1G)。

③病例13:低分化腺癌,lauren分型为弥漫型,瘤细胞呈腺样、条索状排列,浸润性生长,瘤细胞核浆比升高,染色质细腻,细胞异型性显著,间质内少许淋巴细胞分布;分子分型为CIN型(见图1H)。

A.病例2:胃癌lauren分型为弥漫型,分子分型为CIN型;B.病例12:胃癌lauren分型为肠型,分子分型为MSI型;C.病例12:MLH1免疫组化染色显示腺体细胞核呈中等强度着色;D.病例12:MSH2免疫组化染色显示腺体细胞核呈中等强度着色;E.病例12:MSH6免疫组化染色显示腺体细胞核呈中等强度着色;F.病例12:PMS2免疫组化染色显示所有腺体细胞表达缺失;G.病例12:HER-2免疫组化染色呈胞膜强且完整细胞膜的染色;H.病例13:胃癌lauren分型为弥漫型,分子分型为CIN型图1 具有胃癌遗传特征病例(2,12,13)的组织学特点 (×400)Figure 1 Pathological features of patients 2,12,13 with hereditary characteristics of gastric cancer (×400)

2.3 二代测序技术结果

我们统计检测出141个基因突变类型,其中1例(1/15,6.7%)检测出胚系突变:BRIP1(p.T997Rfs*61),同时伴有MUC6、FAT3、TP53、ROS1等体细胞突变。15例检测样本均检测到体细胞突变,重现性体细胞突变基因有TP53(11/15,62.5%),MUC6(4/15,26.7%),MUC16(4/15,26.7%),CRP1B(4/15,26.7%),FAT4(3/15,20%),LRRK2(3/15,20%),PIK3CA(3/15,20%),IDH1(3/15,20%)(见表2)。其中1例(1/15,7%)发现MLH1基因突变,TP53突变中有2例发生突变(C.993+1G>T,C.672+1G>T),导致核苷酸由鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶,2例核苷酸突变为苏氨酸。11例TP53突变病例均为Ⅱ类突变,位点突变亚区主要集中在外显子区域EX7、EX8、EX9,内含子区域IVS6、IVS9。TP53突变组的肿瘤突变负荷(tumor mutation burden,TMB)平均值及总值较TP53野生组高(见表3)。另外,15例患者根据分子分型,MSI组的TMB平均值最高,EBV组的TMB平均值最低(见表4)。

表2 15例胃腺癌患者体细胞突变类型及频率

表3 15例胃腺癌患者TP53基因突变与TMB值的差异表达

表4 15例胃腺癌患者分子分型与TMB值的差异表达

另外,本研究结果发现15例中有3例发生PIK3CA突变,其中1例发现合并MUC16、RAD50、EPPK1、SMARCA4的体细胞突变。我们检测出除TP53的突变外,还包括PIK3CA、CCNE1、CDH1等已知突变的基因。另外,结合最新TCGA数据,我们新发现一些罕见报道的胃癌体细胞突变类型,包括AR,GATA1,FAT3,MGA,DOCK2,COLLA1,LRP1B,SESN1,LRRK2,RECQL,PPM1D,EIF4A2,SRSF2,KMT2B,TGFBR1,FRAS1,SHPRH,ZFHX4,ARID2,ABCG2,EXT2,MAP3K4,MYB,SDE1RAB3,LIRF,CSMD3,APOB,EPPK1,KMT5A,MST1,NKX3-1,ARID,ARID1A,STK40,PRDM14,ATAD2,POLH,KIAA1549,LRRK1,LAMA2,STK19。

2.4 随访结果

对15例胃腺癌患者进行随访,随访时间为40月,其中4例死亡(随访时间为12～32月),11例无病生存。病例5:男性,76岁,胃低分化腺癌患者,伴有淋巴结转移,育3子,1子发现十二指肠息肉,余子尚体健。病例15:男性,65岁,先后发生胃腺癌及肺腺癌,经过2个SOX方案化疗后,随访21个月死亡。

具有胃癌遗传特征的病例随访结果:①病例2:女性,61岁,诊断为胃低分化腺癌,患者父亲于58岁因胃癌手术治疗,组织学分型为低分化胃癌,术后未经放化疗,现年81岁健在,另该患者的母亲、儿子、女儿未发现疾病。患者本人经过5个SOX化疗后,目前无病生存。②病例12:男性,67岁,中分化腺癌,微卫星不稳定患者,随访其三代内未发现其他林奇综合征遗传相关患者。③病例13:女性,78岁,胃低分化腺癌患者,淋巴结转移,育2子4女,其中长子58岁,同年被确诊肺小细胞癌,余子女均体健。

3 讨论

随着基因测序技术的进步,NGS在恶性肿瘤中的应用越来越广泛,由NGS检测结果到转化为患者的个性化精准治疗方案是目前临床重要的治疗方案。NGS能检测出MSI、TMB、胚系突变基因、体细胞突变基因等,为患者寻找靶向药,提供明确的免疫治疗参考。然而,目前国内NGS在胃癌中的研究不够深入,国内外文献报道不一致,胃癌基因谱尚未建立,免疫组化表型特异性检测与二代基因测序检测的差异,NGS检测在判断患者预后分析、疾病转移、发生、发展的临床价值是目前迫切需要探索的内容。

本研究收集15例胃腺癌的肿瘤样本,通过免疫组化染色发现:病例12(1/15,6.7%)PMS2蛋白表达缺失,HER-2高表达(3+),与NGS同时证实发生错配修复系统基因的突变,同时伴有ERBB2的突变。随访其三代内虽然无其他林奇综合征遗传相关患者,考虑与本例为杂合性突变相关。其余14例患者免疫组化未发现错配修复蛋白缺失,NGS也未发现错配修复系统基因的突变。15例样本两种检测结果完全符合。研究发现通过免疫组化及NGS均可发现微卫星不稳定且一致性很高。NGS基因检测不仅可以全面寻找胃癌的突变基因,同时也能确诊微卫星不稳定,在具体检测方法选择上可以结合检测目的和各自方法的优势进行分析。

胚系突变是重要的突变类型,具有重要遗传意义,在胃癌中发生较体细胞突变概率低。本实验中胚系基因突变的发生率为6.7%。病例2发生BRIP1胚系基因突变,合并TP53、FAT3、ROS1、GLI1等体细胞突变。BRIP1胚系基因突变在胃癌中非常罕见,且机制尚不清楚。BRIP1基因位于染色体17q220.2,是一种具有解旋酶功能的氨基酸蛋白,参与DNA内环境平衡[9]。根据OncoKB数据库,大多数BRIP1突变的胃癌是由于错配修复基因或聚合酶ε和δ1基因的伴随突变造成的高突变。BRCA1和BRCA2突变的遗传性卵巢癌中,BRIP1-BRCA1相互作用的缺失在卵巢癌体细胞突变中至关重要[10];0.6%～0.9%的卵巢癌可能携带致病变异BRIP1基因[11]。在缺乏BRCA1或者BRCA2突变的遗传性乳腺癌中同样也发现BRIP1基因突变,导致聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶PARP-DNA复合物形成是肿瘤发生的重要原因[12]。在胃食管癌中,BRIP1扩增通常与ERBB2扩增同时发生,同时在激活的KRAS/BRAF通路基因突变的样本中出现BRIP1突变[13]。奥拉帕利是目前BRIP1突变的有效靶向药。病例2经过奥沙利铂联合替吉奥联合化疗5疗程,目前无病生存。

既往研究发现TP53是胃癌中高频突变基因,与胃癌的发生密切相关,是胃癌形成的重要原因,并贯穿了疾病发生的全过程[14,15],与细胞周期阻滞、凋亡、DNA修复等相关。本研究发现胃癌中TP53突变发生频率最高(11/15,62.5%),与Fenoglio-Preiser等[16]研究结果相同。据报道TP53基因突变患者,合并EB病毒感染较多,预后较好[17],但其与临床表型,如总生存率、无病生存率的相关性尚不明确。本研究发现TP53体细胞基因突变主要发生在外显子。Moroni等[18]发现P53p.V143Ac.428A>C纯合性突变,使得胃癌患者曲妥珠单抗治疗过程中出现耐药,提示TP53可能是胃癌潜在的治疗靶点或耐药靶点。另外本实验发现TP53突变组较野生组具有更高的TMB值,包括均值及总值。TMB值被认为是胃癌免疫微环境的代表值,TMB值越高,越适合免疫治疗[19]。TP53突变导致肺癌、卵巢癌、胰腺癌和皮肤癌等肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞的增加[20],参与多种复杂的信号通路,包括调控基因表达、蛋白质稳定性、蛋白质相互作用和转录后修饰[21],导致趋化因子和细胞因子分泌的改变,进而改变免疫微环境[22,23]。TP53能否成为评估免疫治疗的伴随诊断标志物需要进一步实验证实。

Patricia等[24]指出,TP53基因突变促进细胞侵袭、转移、增殖。本研究发现11例TP53突变患者中有8例发生转移。TCGA公共数据库证实TP53在胃腺癌中的变异频率为49.55%,在胃癌形成及转移中起到重要作用。胃癌晚期转移是死亡的重要原因,因此找到抑制转移的突变位点对于胃癌治疗是一个重要突破点,可以提前进入临床干预,对胃癌的治疗具有重要意义。通过NGS发现TP53基因突变是肿瘤具有转移的高风险因素,为临床发出提前预防转移的重要信号。

E-钙黏蛋白(E-cadherin,CDH1)基因突变与胃癌发生密切相关。病例13胃癌lauren分型为弥漫型,其儿子发生小细胞肺癌,两人同时进行二代基因测序检测,共同发生了TP53、钙黏蛋白-9(CDH9)突变。病例15先后发生胃腺癌及肺腺癌,伴有TP53、CDH1突变。由此发现:钙黏蛋白与肺癌发病高风险具有一定相关性。本研究发现3例(3/15,20%)lauren分型为弥漫型且CDH1体细胞突变,与CDH1基因突变与遗传性弥漫型胃癌有着明确的相关性这一结论一致[25]。CDH1基因突变与遗传性胃癌发病高风险有关[5],发生CDH1基因突变患者预后差[26,27]。当E-钙黏蛋白功能丧失时,表皮细胞的极性消失并且出现克隆性增生和侵袭性生长。CDH9被认为是抑制肿瘤转移的抑制因子,作为转移的驱动因素,成为靶向治疗的备选或联合研究位点[28]。此前,CDH9突变在胃癌中罕见报道,本研究报道为后续进一步研究提供病理依据。

本实验NGS检测发现伴有MUC6、MUC16突变的胃癌患者中5例(5/7,71%)发生转移,说明伴有MUC6、MUC16基因突变患者与胃癌转移高风险相关。既往有文献报道在胃印戒细胞癌中MUC6的表达下调与胃癌的增殖、浸润性生长等临床行为密切相关[29]。MUC6是一种分泌型黏蛋白,主要存在于胃的幽门腺体、十二指肠腺和贲门腺体中,MUC16通过局灶黏附介导的信号机制参与胰腺导管腺癌的转移,通过CRISPR/CAS9介导的MUC16敲除细胞导致胰腺导管腺癌细胞中肿瘤相关碳水化合物抗原减少,提示MUC16-半乳凝素相互作用减少;MUC16可能促进胰腺导管腺癌的生长和转移[30]。NGS检测出MUC6、MUC16基因突变时,提示需要预防胃癌转移的高风险。

NGS选择TMB值排序在20%以上的病例定义为TMB高值,是继MSI-H后的又一个肿瘤免疫治疗伴随诊断标志物[23]。TMB值越高,体细胞突变个数越多,与本研究结果一致。另外,TMB值越高对免疫治疗的应答反应越好[31],说明NGS在胃癌的免疫治疗具有重要提示作用。另外,本研究发现胃癌分子分型4型中MSI组的TMB平均值最高。但是本研究样本量小,遗憾无法进一步评估TMB值与患者免疫治疗疗效、预后的相关性。

综上所述,NGS检测出胃癌发生中的胚系突变及高频体细胞突变的基因类型如TP53、CDH1、CDH9、MUC6、MUC16等,对胃癌发生、转移及免疫治疗等具有重要的临床应用价值,并在临床病理意义分析中发挥重要作用。NGS检测基因突变类型高效、多位点,为临床诊疗提供更加充足的实验室依据。

致谢:感谢西安交通大学第二附属医院病理科杨军主任医师的悉心指导,感谢西安大兴医院胃肠外科施海主任团队为本实验提供样本,同时感谢华大生物检测有限公司为本实验完成二代测序实验部分。